硫化氢参与新生期结肠炎性刺激诱发成年大鼠内脏痛的分子机制研究

摘要

目的：
　　（1）研究CBS调控电压门控型钠通道在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用；
　　（2）研究去甲肾上腺素（NE）通过CBS调控辣椒素受体（TRPV1）在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用；
　　方法：
　　1.对出生十天的新生期雄性大鼠在肛门处插入2cm注射0.2ml的0.5%的冰醋酸(AA)造成新生期结肠炎性刺激(NCI)从而诱导成年大鼠的结肠慢性痛过敏模型。运用腹壁撤回评分（AWR score）方法评测NCI大鼠的痛行为反应。
　　2.结肠管壁注射荧光素（DiI）来标记结肠特异性背根节（DRG）神经元，运用全细胞膜片钳方法研究NCI大鼠中肠相关DRG神经元电压依赖型钠通道的变化特性。
　　3.运用ELISA试剂盒检测NCI模型大鼠血清中去甲肾上腺素（NE）的水平。
　　4.运用Western Blotting方法检测NCI模型大鼠肠相关DRG神经元中CBS,钠通道蛋白和TRPV1受体蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.NCI明显增加大鼠对结肠扩张的过敏反应，六周时，AWR评分显著高于对照组，这种痛觉反应持续至少三周。在第十周和第十二周时，AWR评分恢复到正常水平。
　　2.NCI增加肠相关DRG神经元（T13-L2）电压门控型钠通道的电流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平。而十周龄时NCI组和对照组的肠相关DRG神经元电压门控型钠通道的电流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平均没有显著差异。同样地，我们检测了六周龄NCI组和对照组的非肠相关神经元(L4-5)DRG，发现电压门控型钠通道的电流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平均没有显著差异免疫组化三标技术显示在DRG肠特异性神经元中CBS和NaV1.7或NaV1.8共表达。
　　3.与对照组相比，NCI组CBS的表达水平显著上调。CBS的拮抗剂AOAA翻转NCI引起的大鼠内脏痛觉反应，最优剂量10mg/kg的药效持续至少一个小时。并且，AOAA翻转NCI引起的肠相关DRG神经元钠电流密度的增加和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平的增加。
　　4.在最佳剂量下，非选择性β肾上腺素受体拮抗剂，而不是α肾上腺素受体拮抗剂，明显翻转由HIS诱导的大鼠结肠痛过敏。进一步研究发现，阻断β2肾上腺素受体明显降低由应激导致的AWR高评分，而β1和β3肾上腺素受体拮抗剂对这种高评分没有明显作用。
　　5.NE参与内脏痛敏感的形成。与对照组相比，ELISA结果显示，NCI大鼠血清NE激素水平显著上调。但是，β2受体蛋白表达水平与对照组相比没有明显变化。而且，去甲肾上腺素能诱导大鼠内脏痛过敏反应。
　　6.TRPV1表达水平上调是由NE介导的。NCI大鼠肠相关DRG神经（T13-L2）中，TRPV1蛋白表达显著上调。给予正常大鼠NE，肠相关DRG神经元（T13-L2）中 TRPV1的蛋白表达水平显著上调。给予 NCI组大鼠非选择性肾上腺素受体β拮抗剂，显著降低TRPV1蛋白表达水平。用细胞培养的方法，NE孵育正常大鼠的DRG细胞，CBS表达水平显著上调。
　　7.CBS参与NCI-TRPV1痛觉信号通路的传递。给予正常大鼠NE，肠相关DRG神经元（T13-L2）中CBS的蛋白表达水平显著上调。给予NCI组大鼠非选择性肾上腺素受体β拮抗剂，显著降低CBS蛋白表达水平。给予NCI组大鼠CBS拮抗剂AOAA，显著降低TRPV1蛋白表达水平。
　　8.用细胞培养的方法，NE孵育正常大鼠的DRG细胞，CBS和TRPV1表达水平显著上调。
　　结论：
　　NCI可能通过CBS介导的两条信号通路诱导大鼠内脏痛觉过敏。一条通路是， CBS通过介导电压门控型钠通道诱导内脏痛；另外一条是，NCI诱导产生的去甲肾上腺素可能激活了大鼠初级感觉神经元的β2受体，β2受体激活后通过CBS介导肠相关DRG神经元中TRPV1活性的增加诱导内脏痛。因此，本研究在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如IBS病人慢性内脏痛产生的分子机制，从而可能为慢性内脏痛的治疗提供更有效的方案。

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第一章 引言

第二章 材料与方法

2.1 实验对象

2.2 新生期结肠炎性刺激症（ Neonatal Colonic Inflammation ，NCI）模型的建立

2.3 腹壁撤回反射(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR) 评分检测痛阈

2.4 Western Blotting检测蛋白表达

2.5 急性分离DRG神经元和全细胞膜片钳实验

2.7原代DRG细胞培养

2.8 免疫组化

第三章 实验结果

第一部分 CBS调控电压门控型钠通道在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用

第二部分 去甲肾上腺素（NE）通过CBS调控辣椒素受体（TRPV1）在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用

第四章 讨论

参考文献

综述

攻读硕士学位期间公开发表的论文、会议摘要和奖励

致谢