KIR基因对异基因造血干细胞移植预后的影响及其机制研究的初步探讨

摘要

本文从以下及部分进行了论述。　　第一部分 KIR基因型、单倍型和受配体模式分析对异基因造血干细胞移植预后的影响　　目的:建立杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin receptor,KIR)基因型、单倍型及受配体缺失模式,分析其对异基因造血干细胞移植(allogeneic hemotopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)预后的影响。　　方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应方法,对进行HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨的供、受者进行KIR检测,建立三种KIR分型模式(供受体KIR基因模式、KIR/HLA受配体缺失模式、供体KIR单倍体模式)。　　结果:1.供受体KIR基因模式:即供者与受者KIR受体基因是否相合。当供受者KIR基因型完全相合时,即为供受体KIR基因相合。当供受者KIR不完全相合时即为供受者KIR基因错配。　　2.供受体KIR/HLA受配体模式分析:当受者缺乏与供者KIR相合的HLA配体时即为供受体KIR/HLA受配体缺失模式。　　3.KIR单体型分型:①A单体型:以抑制性KIR(iKIR)为主,仅有唯一的激活性KIR为KIR2DS4,KIR2DS4可进一步分为2DS4完整型、2DS4完整/缺失型、2DS4缺失型三组亚型;②B单体型:包含多种激活性KIR(aKIR)(KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DSl)的不同组合。KIR-A/A基因型仅包含A单体型,KIR-A/B基因型同时包含A单体型和B单体型, KIR-B/B基因型仅包含B单体型,A/B基因型和B/B基因型合称为B/x基因型。A/A基因型可分为AA-1(完整型),AA-2(完整/缺失型)和AA-3(缺失型)。B单体型可分为15种不同的单体B1–B15。KIR单倍体根据其基因在着丝粒(centromeric, Cen)和端粒端(telomeric,Tel)的分布可进一步分析。　　结论:供受体KIR基因型模式、供受体KIR/HLA受配体模式及供体KIR单倍体模式的建立对于分析KIR基因对异基因造血干细胞移植预后的影响具有重要意义。　　第二部分 KIR基因对恶性血液病患者同胞HLA全相合造血干细胞移植预后的影响　　目的:探讨KIR基因型及单倍型对同胞全相合造血干细胞移植的影响。　　方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应方法,对219对HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨基因分型全相合的同胞供、受者进行KIR基因分型,分别应用供受体KIR基因模式、KIR/HLA受配体缺失模式、供体KIR单倍体模式及其着丝粒(Cen)和端粒端(Tel)分析KIR对同胞全相合造血干细胞移植预后的影响。　　结果:2005年3月~2012年10月在苏州大学附属第一医院接受同胞HLA全相合造血干细胞移植的219例患者中,男性120例,女性99例。其中AML111例,MDS17例, ALL40例,CML33例,NHL18例。中位年龄38岁(8岁-63岁)。中位随访时间14月(3月-93月),6例失访。所有患者均接受清髓性预处理。192例患者接受BuCy预处理,27例患者接受TBI+Cy预处理。回输干细胞量CD34+细胞:3.79(1.36-12.0)×106/kg。五年总生存率(OS)为76.2％,无复发生存率(RFS)为69.6％。AML/MDS, ALL和CML的OS分别为72.7％,67.9％和93.5％(P=0.156)。　　在供受体KIR基因模式中,供受体KIR基因不合组5年OS明显高于相合组(87.3％vs.69.3％;P=0.0268),Ⅲ-Ⅳ急性GVHD低于相合组(4.6％vs.13.6％;P=0.029)。在KIR/HLA受配体缺失模式中,受体HLA为C1组与C2组比较,急性GVHD的发生率明显下降(23.2％vs.43.2％;P=0.002),在AML患者中效果更显著(21.5％vs.49.0％;P=0.001)。在供体KIR单倍型模式中,供体KIR基因型为Bx1者预后最差,和供体KIR基因型为其他Bx类型比较,其OS(100.0％vs.64.5％; P=0.0013)和RFS(100.0％vs.62.2％;P=0.0005)明显降低。而Bx1基因型的B单倍体位于端粒端,故进一步分析KIR的B单倍体位于端粒端和着丝粒端时对预后的影响。结果显示当供体KI R含有着丝粒端的B单倍体(Cen-B)时,移植的预后较好,OS(96.6％vs.72.0％;P=0.0169)和RFS(96.9％vs.61.3％; P=0.0056)明显提高,且复发率明显下降(2.9％vs.15.7％; P=0.047)。　　同胞HLA全相合造血干细胞移植CMV感染率为34.2％(75/219),中位感染时间为62天(26~265天),其中CMV病毒血症发生率为4.6％(10/219),3例患者发生CMV肺炎。供受体KIR基因相合组中受体移植后CMV激活发生率35.6％(47/132),不合组CMV激活发生率32.2％(28/87),两组间无统计学差异(P=0.663)。供体KIR基因为A/A型,受体移植后CMV激活发生率39.5％(49/124),供体KIR基因为A/B型,CMV激活发生率30.3％(23/76),供体KIR基因为B/B型,CMV激活发生率15.8％(3/19)。供体KIR基因为A/A型与B/B型比较,两者有统计学意义(P=0.036)。供体KIR含Tel-B时,移植后CMV激活发生率为24.4％(20/82),明显低于供体无Tel-B时CMV激活率40.1％(55/137)(P=0.017)。　　多因素分析提示供体KIR含Cen-B时OS(HR,8.293;95％ CI,1.072–64.169;P=0.043)和RFS(HR:11.63;95％CI,1.51–89.566;P=0.018)明显提高,其作用主要体现在对复发的保护作用(HR,4.363;95％CI;1.184–16.08;P=0.027)。而受体HLA为C2是发生急性GVHD的危险因素(HR:0.316,95％CI:0.160–0.625,P=0.001)。分析KIR基因在ALL和CML患者移植的预后,其作用无统计学意义。　　结论:同胞全相合造血干细胞移植是治疗恶性血液病的重要手段,但移植的预后却存在很大差异。本研究对KIR基因B单倍体进行着丝粒及端粒端分析,并第一次分析其对同胞HLA全相合造血干细胞移植预后的影响,结果提示供体KIR含有Cen-B时对复发有保护作用,从而提高生存率,改善预后。供受体KIR基因不合可改善同胞全相合造血干细胞移植的预后。在KIR/HLA受配体缺失模式中,受体HLA为C2是发生急性GVHD的危险因素。而上述KIR的作用在AML患者中效果更显著。　　第三部分建立KIR/HLA受配体缺失体外模式及激活性KIR2DS4基因高表达的机制研究　　目的:建立体外KIR-A/A型的自然杀伤(NK)细胞与树突状细胞(DC)共培养的模型,分析aKIR2DS4高表达的机制。　　方法:检测受体HLA分型,分为HLA-C1组(C1/C1)和C2组(C1/C2和C2/C2),在分选供体NK细胞前5-7天进行受体外周血单个核细胞衍生而来的DC培养;检测供体KIR基因,挑选KIR基因型为AA-1或AA-2的供体为实验组,KIR-A/B(2DS4 Ful或Ful/Del)为对照组,分选供体CD3–CD16+CD56+NK细胞与DC共培养16-24小时,观察结果。　　结果:供体NK细胞与受体DC细胞共培养后,当浓度达2.5:1及以上时,2DS4表达增高。在KIR-A/A组中,当NK细胞:DC细胞浓度达2.5:1及以上时,与NK(加IL-2)比较,2DS4表达明显升高(P=0.002),而在KIR-A/B组中无此规律。供体为KIR-AA-1者NK细胞表面2DS4阳性率(74.4±14.8)％,AA-2者2DS4阳性率(37.7±30.6)％,两者有统计学差异(P=0.030)。当NK细胞与DC细胞按2.5:1共培养后,AA-1者2DS4表达升高(P=0.006),按5:1共培养后,AA-1者2DS4表达升高(P=0.003);AA-2者NK细胞与DC细胞按5:1共培养后2DS4表达也有升高(P=0.027)。NK细胞与C1组DC细胞共培养后,与NK(加IL-2)组相比,2DS4表达明显升高(P=0.009),而与C2组DC细胞共培养后,2DS4表达略有升高,但无统计学意义(P=0.435)。　　结论:本实验成功建立了KIR/HLA缺失的体外模型,并且证实当KIR/HLA发生错配时,活化型受体CD3–CD16+CD56+NK细胞直接杀伤靶细胞的异源反应活性增强,为前期的临床研究提供了理论依据,同时也为下一步NK细胞的功能试验奠定了基础。

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前言

参考文献

第一部分 KIR基因型、单倍型和受配体模式分析对异基因造血干细胞移植预后的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第二部分 KIR对恶性血液病患者同胞全相合造血干细胞移植预后的影响

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第三部分 建立KIR/HLA受配体缺失体外模式及激活性KIR 2DS4基因高表达的机制研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

综述异源反应性自然杀伤细胞在异基因造血干细胞移植中的作用

攻读学位期间公开发表的论文

英文缩略词表

致谢