苏州地区儿童肺炎支原体基因亚型及与疾病严重程度相关性研究

摘要

目的:　　对苏州地区急性呼吸道肺炎支原体(Mycoplasma penumoniae,MP)感染患儿呼吸道分泌物标本进行MP P1基因分型,并进行基因测序,探讨苏州地区肺炎支原体流行亚型,及其基因变异情况;同时收集不同型别 MP感染患儿的临床资料,探讨MP亚型与疾病严重程度之间的相互关系。　　方法:　　选取2012年1月-2013年12月苏州大学附属儿童医院急性呼吸道MP感染患儿(共313例,包括门诊MP感染患儿49例,住院肺炎支原体肺炎患儿264例)的呼吸道分泌物为研究对象。　　1.MP DNA提取:收集门诊患儿咽试子及住院患儿鼻咽部分泌物;提取MP DNA,进行荧光定量PCR,选取经PCR荧光探针法测定浓度>2.5*10^3(包括2.5*10^3)的标本作为下一步MP分型标本。　　2.MP基因分型:通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)和巢式多重PCR对313株Mp临床分离株进行P1基因分型,并比较这2种方法在基因分型中的作用。　　3.MP基因测序:挑选部分P1-Ⅰ型及P1-Ⅱ型标本进行PCR反应,将其产物进行P1基因测序。　　4.临床资料收集:收集并比较不同型别 MPP(Mycoplasma penumoniae penumoniae,MPP)住院患儿的下列临床资料:性别、年龄、临床表现、并发疾病,实验室及影像学检查结果及治疗情况等。　　结果:　　1.通过对313例临床标本进行P1基因分型发现,通过PCR-RPLF方法检出P1-Ⅰ型32例(10.22％),P1-Ⅱ型1例(0.32％),280例(89.46％)均无P1-Ⅰ及P1-Ⅱ型型别检出;巢式多重PCR方法检出P1-Ⅰ型304例(97.12％),P1-Ⅱ型8例(2.56％), V2型变异株1例(0.32％),提示研究期间,苏州地区发生的MP感染以P1-Ⅰ型为主。将PCR-RPLF方法与巢式多重PCR方法进行对比发现,巢式多重PCR方法对急性呼吸道 MP感染患儿呼吸道分泌物标本提取的DNA进行 P1基因分型明显优于PCR-RPLF方法(P<0.05)。　　2.将测序标本的核苷酸序列在Genebank中用 BLAST与标准株 M129的P1基因(Sequence ID:NC_000912.1)比较发现3株P1-Ⅰ型临床标本中有2株发生点突变,另1株 P1-Ⅰ型临床标本与 M129标准株基因序列一致。3株 P1-Ⅱ型临床标本与MP-FH标准株基因序列一致。　　3.MPP住院患儿临床资料分析显示P1-Ⅰ型与P1-Ⅱ型MPP患儿在平均住院时间及发热时间无明显差异(P>0.05)。P1-Ⅰ型与P1-Ⅱ型MPP患儿在白细胞、CRP以及临床肺部感染评分(The Clinical Pulmonary Infection Score,CPIS)上无明显差异(P>0.05)。P1-Ⅱ型MPP患儿的血中性粒细胞比例高于P1-Ⅰ型MPP患儿。1例V2型MP感染患儿为非难治性肺炎支原体肺炎感染表现。　　结论:　　1.2012年1月—2013年12月苏州地区发生的MP感染以P1-Ⅰ型为主,发现1例V2变异株。　　2.巢式多重PCR方法能够直接有效的对MP感染患儿呼吸道分泌物进行P1基因分型。　　3.MP P1-Ⅰ型及P1-Ⅱ型与肺部感染严重程度可能无明显相关性。V2变异株与疾病严重程度相关性有待进一步研究。

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引言

对象与方法

一、研究对象

二、主要仪器设备和试剂

三、方法

结果

4.1 MP临床标本基因分型结果

4.2测序结果

4.3临床资料统计分析

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间公开发表论文

中英文对照缩略词表

致谢