软脂酸三甲基壳聚糖聚合物包载去氢骆驼蓬碱肝肿瘤靶向自组装胶束研究

摘要

目的：以三甲基壳聚糖(Trimethyl-chitosan,TMC)为基础，合成三种两亲性可发生自组装的聚合物分子，包括软脂酸三甲基壳聚糖1和2(Palmitoyl-trimethyl-chitosan1 and2,TPCS1 and TPCS2)，以及乳糖酸修饰的软脂酸三甲基壳聚糖(Lac-palmitoyl-trimethyl-chitosan, Lac-TPCS2)，并以其为载体，以难溶性药物去氢骆驼蓬碱(Harmine，HM)为模型药物，其疏水性的内核可以包载增溶HM制备三种载药胶束(TPCS1/HM, TPCS2/HM,和Lac-TPCS2/HM)，缓慢释放HM降低毒副作用同时结合载体靶向作用实现HM在体内对肝脏部位肿瘤的有效递送，增强HM的抗肝癌疗效。　　方法：(1)通过烷基化反应合成三甲基壳聚糖，接着通过缩合法合成TPCS1， TPCS2和Lac-TPCS2。通过红外光谱、1HNMR表征三种聚合物的结构，测定其临界胶束浓度(Critical micellar concentration，CMC)。以TPCS2为例，采用薄膜分散法制备载去氢骆驼蓬碱的胶束，通过单因素和星点设计等方法优化载药胶束的处方工艺。利用红外光谱等技术对其进行表征，并考察不同介质中三种载药胶束的释放特性。(3)以人源性肝肿瘤细胞株HepG2为体外细胞模型，采用MTT法研究胶束的细胞毒性，并将细胞摄取过程假设为一级动力学模型来研究胶束的摄取及消除过程，同时采用原子力显微镜，荧光显微镜，共聚焦显微镜以及流式细胞术多种方式探索药物的摄取过程和作用机制，定量定性地考察三种胶束对肝肿瘤细胞的亲和性，并借助不同抑制剂细致研究了HepG2细胞吞噬胶束的途径。(4)以H22荷瘤小鼠为肿瘤模型动物，考察胶束在小鼠体内的抗肿瘤活性，并初步研究了其安全性。(5)以H22荷瘤裸鼠为肿瘤模型动物，Cy7标记纳米胶束载体Lac-TPCS2，采用小动物活体成像技术考察其在小鼠体内的吸收分布情况。　　结果：(1)合成了两种软脂酸取代度的TPCS1和TPCS2，以及Lac-TPCS2，其结构得到红外图谱和1HNMR谱的表征；测定其临界胶束浓度约为10-2mg/mL，其中TPCS2临界胶束浓度略小，是由于软脂酸取代较高对形成胶束更为有利。通过单因素试验，星点试验优化载药胶束的制备处方。对胶束各方面特性进行表征:三种胶束的平均粒径约为200nm，其中TPCS2/HM的包封率为(91.15±0.14)%，载药量(14.58±0.23)%。电镜照片显示胶束外观圆整，粒径分布均匀。三种纳米胶束释放行为均体现出显著的缓释特性，其中软脂酸取代较大的TPCS2/HM释放更为缓慢，且在酸性pH下释放更为迅速。(2)和原药HM相比胶束对肝肿瘤细胞HepG2更具亲和性，细胞毒作用更显著。一级动力学拟合评价 HepG2细胞的体外摄取情况：胶束的吸收情况明显优于原料药HM，且消除时间也较长。经证实胶束可能是通过网格蛋白以及小窝蛋白介导的内吞途径进入HepG2细胞内，且Lac-TPCS2的内吞受到受体介导，可发生溶酶体逃逸。(3)HM是通过诱导细胞凋亡途径致细胞死亡的，并可以影响到细胞周期，胶束具有更好的致细胞凋亡效果。(4)三种胶束可有效增加HM的抗肿瘤作用，其中乳糖酸修饰的胶束Lac-TPCS2/HM对比未修饰组TPCS1/HM和TPCS2/HM，有更好的抗肿瘤效果，并可明显延长小鼠的生存时间。(5)小动物活体成像实验显示了Cy7标记的Lac-TPCS2/HM较好的肝脏和肿瘤靶向性。　　结论：优化的载去氢骆驼蓬碱胶束工艺简单易行，包封率载药量较高。三种载药胶束在体外均具有缓释特性，且软脂酸取代度高可延缓药物释放。体外细胞实验显示载药胶束能明显增加肝癌细胞对药物的摄取，在体内可降低HM的副作用并显著提高药物的抗肿瘤作用，其中TPCS2较TPCS1有较好的亲和性以及蓄积效应抗肿瘤效果较好，而Lac-TPCS2可以通过受体配体途径发挥主动靶向达到最佳治疗效果，且具有较好的安全性。研究结果显示，Lac-TPCS2/HM是最有开发潜力并有望成为一种新型的纳米基因载体。

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引言

第一章 去氢骆驼蓬碱的处方前研究

材料

方法与结果

讨论与小结

第二章 嵌段聚合物载体的合成

材料

方法与结果

讨论与小结

第三章 载药胶束的制备与工艺优化

材料一、试药

二、仪器

方法与结果

讨论与小结

第四章 体外药效学和摄取机制评价

材料

方法与结果

讨论与小结

第五章 体内药效学及安全性考察

材料

方法与结果

讨论与小结

第六章 近红外小动物活体成像

材料

方法与结果

讨论与小结

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的论文与其它

一、攻读学位期间完成及发表的论文

二、攻读学位期间参加的学术会议

三、攻读学位期间所获奖项

英文缩略词表

致谢