利用CRISPR/Cas9技术对斜纹夜蛾GOBP基因的沉默及其检测

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摘要

英文缩略语

第一章文献综述

1．1昆虫嗅觉感受及其相关蛋白

1．1．1昆虫嗅觉感器

1．1．2嗅觉传导机制

1．1．3气味结合蛋白

1．2 CRISPR／Cas系统的介绍

1．2．1 CRISPR／Cas系统的发现

1．2．2 CRISPR／Cas结构和组成

1．2．3 Ⅱ型CRISPR／Cas9系统的工作原理

1．3突变体基因组DNA的获取

1．4本研究的意义

第二章利用末龄幼虫蜕或者蛹对单头昆虫基因的无损伤检测

2．1材料和方法

2．1．1昆虫饲养及样品收集

2．1．2主要仪器设备

2．1．3主要试剂

2．1．4 gDNA的提取

2．1．5 PCR扩增及单克隆测序

2．2结果与分析

2．2．1三种昆虫末龄幼虫蜕及蛹壳的比较

2．2．2幼虫蜕及蛹壳的gDNA提取

2．2．3靶标基因的PCR扩增

2．2．4靶标基因PCR产物的单克隆测序

2．3讨论

第三章利用CRISPR／Cas9技术对斜纹夜蛾GOBP1和GOBP2基因的敲除

3．1材料和方法

3．1．1供试昆虫

3．1．2主要仪器设备

3．1．3主要试剂

3．2实验方法

3．2．2 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录合成

3．2．3斜纹夜蛾卵的显微注射

3．2．4注射当代(G0代)卵的检测

3．2．5 G1代突变体的无损伤检测

3．3结果与分析

3．3．1靶标位点的选择及sgRNA的合成

3．3．2显微注射后突变的检测

3．3．3筛选GOBP1基因和GOBP2基因突变体

3．4讨论

第四章一种突变型PBP1对性信息素等气味物质的结合能力测定

4．1材料和方法

4．1．1供试昆虫和组织收集

4．1．2主要仪器设备

4．1．3主要试剂

4．1．4昆虫总RNA的提取和cDNA第一链的合成

4．1．5目的基因的PCR扩增、克隆和测序

4．1．6重组蛋白的表达和纯化

4．1．7目的蛋白的荧光竞争性结合测定

4．2结果与分析

4．2．2突变型PBP1与1-NPN的结合能力

4．2．3突变型PBP1与不同配基的结合能力

4．3讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录