CRISPR/Cas9技术应用于斜纹夜蛾GOBP2基因功能研究的探讨

摘要

CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌体内发现的一种获得性免疫机制，通过嵌合的双链RNA介导的Cas9蛋白对靶基因进行基因组编辑，从而沉默靶基因的表达。通过不断改进，将该系统用于基因敲除具有效率高、周期短、操作简单、经济等特点，已经成功应用于多种模式昆虫（包括果蝇、家蚕等）的基因组编辑中，但在非模式昆虫中应用很少，更未见有在嗅觉基因功能研究中的应用。斜纹夜蛾Spodoptera litura属夜蛾科，是一种世界性分布的重要农业害虫。普通气味结合蛋白(General odorantbinding protein，GOBP)高浓度存在于嗅觉感器的液腔内，负责将进入感器内的脂溶性寄主植物气味结合并运输到嗅觉神经树突表面的受体（Olfactory recetptor, OR）部位，但受技术所限其生理功能一直缺乏活体研究的直接证据。本研究探讨了CRISPR/Cas9技术在斜纹夜蛾GOBP2基因敲除中的应用，获得了多种不同类型的突变嵌合体，并经筛选得到1个GOBP2基因缺失了3个碱基并插入6个碱基的斜纹夜蛾突变品系。利用触角电位仪(Electroantennography，EAG)进行电生理测定表明，和野生品系相比，该突变品系对几种植物挥发物的EAG反应显著降低，说明该突变降低了GOBP2对特定气味物质的结合能力，同时也说明GOBP2在斜纹夜蛾的嗅觉中起重要作用，主要结果如下:
　　1.利用CRISPR/Cas9系统敲除斜纹夜蛾GOBP2基因
　　根据斜纹夜蛾GOBP2的基因组DNA序列和CRISPR/Cas9系统靶标位点的选择要求，在第二外显子上选择了1个靶标位点，然后根据靶标位点序列体外合成了sgRNA，同时体外转录合成Cas9 mRNA。收集产后2h内的斜纹夜蛾卵并在6h内通过显微注射法将sgRNA和Cas9 mRNA导入（约1nL/卵）到卵中。注射24 h后，随机挑取20粒卵混合后提取基因组DNA，利用PCR扩增GOBP2，产物经限制性内切酶酶切并凝胶电泳检测发现有突变发生，通过电泳条带相对强度估测突变率为49.3％;同时对PCR产物测序发现自靶标位点处开始出现套峰，也证实了突变的发生;将PCR产物连接转化后选取20个阳性克隆进行测序，发现有11个克隆发生突变计10种突变类型。将突变个体互相配对筛选至第三代，获得1个GOBP2缺失3个碱基并插入6个碱基的突变杂合品系。
　　2.斜纹夜蛾GOBP2基因突变个体触角电位反应的测定
　　对获得的G3代突变杂合品系，利用触角电位技术测定了成虫对5种植物挥发物和3种性信息素组分的电生理反应;测定结束后对突变杂合品系检测个体进行基因型（突变纯合、杂合及野生型）检测，据此分析不同基因型间的电生理反应差异。结果表明，对雌虫而言，植物挥发物剂量在500和5000 ng时，突变个体（包括纯合突变和杂合突变）与野生型个体间的EAG反应均无显著差异;3个性信息素组分中，只有Z9，E12-14:AC在500 ng时，纯合突变个体的EAG反应比野生型个体显著降低。对雄虫而言，某些植物挥发物（己醇、苯乙醛、水杨酸甲酯）在2个测定剂量下，突变型个体的EAG反应均显著低于野生型个体;但性信息素组分中，Z9，E11-14:AC和Z9-14:AC只在50 ng剂量时，杂合突变个体的EAG反应显著低于野生型个体，纯合突变个体与野生个体之间没有显著性差异。综合而言，该品系的突变型GOBP2对雌虫的影响不明显，但显著降低了雄虫对某些植物挥发物的感受，并一定程度上降低了对性信息素组分的感受。
　　本研究证实了CRISPR/Cas9系统应用于鳞翅目昆虫非模式种的基因敲除的可行性，为相关研究提供了重要技术参考。鉴于本研究所得到的斜纹夜蛾GOBP2突变品系只引起3个氨基酸的变化，为了确切证实GOBP2的生理功能，进一步的工作有待筛选获得彻底丧失GOBP2功能（基因无法表达或产物大片段缺失）的突变品系，并同时进行电生理及行为方面的测定。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 CRISPR／Cas系统的基本介绍

1．1 CRISPR／Cas系统的研究进展

1．2 CRISPR／Cas的结构组成

1．3 CRISPR／Cas的分类

2 CRISPR／Cas9系统的研究进展

2．1 CRISPR／Cas9的发现

2．2 CRISPR／Cas9系统在基因编辑中的应用

2．3 CRISPR／Cas9系统基因编辑的机制

2．4 CRISPR／Cas9系统的脱靶效应

3 昆虫的嗅觉感器及嗅觉感受机制

4 昆虫普通气味结合蛋白的研究进展

5 斜纹夜蛾发生、危害和防治的研究

5．1 斜纹夜蛾的生物学和生态学特征

5．2 斜纹夜蛾的为害特征

5．3 斜纹夜蛾的防治

6 本研究的目的和意义

第二章 利用CRISPR／Cas9系统敲除斜纹夜蛾GOBP2基因

1 实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 靶标位点的选择及sgRNA和Cas9 mRNA的合成

2．2 卵的注射及突变检测

2．3 突变单对系的筛选

2．4 脱靶效应的检测

3 讨论

第三章 SlitGOBP2突变个体触角电位反应的测定

1 实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 测试个体的基因型检测

2．2 触角电位反应

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢