波尔山羊-牛种间体细胞核移植的研究

摘要

本试验以体外培养的波尔山羊耳成纤维细胞为供核细胞，牛体外成熟的卵母细胞为受体胞质，研究了波尔山羊，牛异种体细胞核移植中的重要技术环节，旨在初步建立波尔山羊-牛异种体细胞核移植技术平台。 论文包括6个相对独立的试验，首先研究了牛卵巢运输中保存温度和运输时间对卵母细胞体外核成熟的影响，结果发现卵巢历经10～12 h运输至实验室，26～30℃保存时卵母细胞体外核成熟率显著高于16～20 ℃和21～25 ℃时(78.94±4.5 vs．72.08±5.9 vs．68.70±3.3，P<0.05)；卵巢保存在20～25℃时，运输时间4～6h组和10～12 h组的卵母细胞体外核成熟率之间无显著差异(P>0.05)。研究了卵丘细胞对卵母细胞体外核成熟和孤雌发育的影响，结果发现卵母细胞周围卵丘细胞存在时，卵母细胞的核成熟、孤雌胚囊胚发育率均显著高于机械脱除卵丘细胞的卵母细胞组(71.49±5.5 vs．39.12±10.3，P<0.05；35.24±5.6 vs．22.60±2.7，P<0.05)；根据卵丘细胞层数和是否附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)将COCs分类后进行成熟培养和孤雌激活，结果发现附带不同层数卵丘细胞和附带FSP的卵母细胞体外核成熟率之间无显著差异(P>0.05)，孤雌胚卵裂率上附带5层以上卵丘细胞的卵母细胞组显著高于附带FSP的COCs组(79.90±16.7 vs．66.94±11.4，P<0.05)，但囊胚发育率上附带5层以上卵丘细胞的卵母细胞组和附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs组显著高于附带4层以下卵丘细胞的卵母细胞组(27.60±5.1 vs．30.06±4.0 vs．20.36±4.3，P<0.05)。探索了不同融合电压对异种重构卵的融合率和死亡率的影响，结果发现230v/10μs组的重构卵融合率显著高于200v/mm，10μs组和250v/mm，10μs组(53.16+5.9 vs．26.97±3.8 vs．33.07±8.1，P<0.05)，并且230v/mm，10μs组的重构卵死亡率较低。比较了不同重构卵构建方法(透明带下注射法和全细胞胞质内注射法)的构建率及对重构胚胎后期发育的影响，结果发现两种构建方法在构建率、重构胚胎卵裂率和囊胚发育率之间均无显著差异(P>0.05)。采用了不同卵丘细胞共培养对重构胚胎发育的影响，结果发现卵丘细胞共培养组的重构胚胎囊胚发育率显著高于非共培养组(24.66±5.1 vs．24.21±4.9vs．17.64±1.4，P<0.05)，而原代卵丘细胞共培养组与传代(3代)卵丘细胞共培养组的重构胚胎囊胚发育率之间无显著差异(P>0.05)。尝试了50 nM TSA处理对山羊-牛异种克隆胚胎发育的影响，结果发现对异种克隆胚胎进行TSA处理48 h的囊胚发育率显著高于处理0h和24 h(33.85±2.8 vs．19.07±3.7 vs．23.82±3.2，P<0.05)。 总之，本研究初步建立了山羊-牛异种体细胞核移植技术平台。通过26～30℃保存牛卵巢至实验室，选择附带5层以上卵丘细胞或FSP的卵母细胞体外成熟后作为受体细胞，将山羊体细胞经透明带下注射(电融合法)或胞质内注射与受体细胞构建重构卵，经化学激活后采用卯丘细胞共培养或50 nM TSA处理48 h，异种克隆胚胎体外培养可发育至囊胚期。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

文献综述：哺乳动物异种体细胞核移植技术研究进展

引言

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要试剂与溶液

1.3主要仪器

1.4试剂与溶液的配制

1.5山羊体细胞的体外培养

1.6牛卵母细胞的体外成熟

1.7牛卵母细胞的孤雌激活与孤雌胚培养

1.8异种重构卵的构建方法

1.9异种重构卵的融合与激活

1.10异种重构胚胎的体外培养

1.11试验设计

1.12数据处理

2结果与分析

2.1卵巢保存温度和运输时间对牛卵母细胞体外核成熟的影响

2.2卵丘细胞对卵母细胞体外核成熟与孤雌发育的影响

2.3融合电压对重构卵融合率和死亡率的影响

2.4重构卵构建方法对重构胚胎构建率和胚胎发育的影响

2.5卵丘细胞共培养对重构胚胎发育的影响

2.6曲古抑菌素(TSA)处理对重构胚胎发育的影响

3 讨论

3.1卵巢保存温度和运输时间对卵母细胞核成熟的影响

3.2卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育能力的影响

3.3融合电压对重构卵融合率和死亡率的影响

3.4构建方法对重构胚胎体外发育的影响

3.5卵丘细胞共培养对重构胚胎体外发育的影响

3.6曲古抑菌素(TSA)处理对重构胚胎体外发育的影响

4结论

参考文献

致谢

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