聚乙二醇化天花粉蛋白注射液质控方法和质量标准的初步研究

摘要

为了建立聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的质量标准和质控方法。首先，参照天花粉蛋白的检测方法、中国药典要求及新药注册指导原则，并结合聚乙二醇天花粉蛋白(PEG-TCS)的性质及其修饰过程在以下几个方面对聚乙二醇天花粉蛋白进行了质控方法学研究并拟定了相关标准：HPLC考察样品纯度方法建立与验证；聚乙二醇染色法对聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中游离PEG检测方法建立；聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中NaCNBH<,3>残留考马斯亮蓝试剂法检测方法建立及与碘滴定法的比较；Lowry法测定聚乙二醇化天花粉蛋白中蛋白含量的专属性考察；小鼠引产活性考察聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的体内活性的生物活性测定方法建立等．然后，根据质控方法学研究的结果及其他检测项目参照药典建立了聚乙二醇天花粉蛋白注射液的质量控制标准检测项目并对三批样品进行了检测：采用免疫印迹和聚乙二醇染色法对聚乙二醇化天花粉蛋白进行鉴别；用还原型SDS-PAGE法测定聚乙二醇化天花粉蛋白相对分子量；采用考马斯亮蓝试剂法对聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中NaCNBH<,3>残留进行检测；采用聚乙二醇染色法对聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中游离PEG进行了检测；利用非还原型SDS-PAGE法、SEC-HPLC法对聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的纯度进行了测定；小鼠引产活性考察聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的体内活性，聚乙二醇化天花粉蛋白注射液外观、装量、等电点、紫外扫描、pH、细菌内毒素、无菌等其它指标按照《中国药典》三部的相关规定进行。 HPLC考察纯度色谱条件下，PEG-TCS与TCS的分离度良好(≥ 2.0％)，回归方程为A=307.53C-371，r=0.9983表明TCS在5～50μg/ml浓度范围内线性关系良好，测得三批样品中残留的TCS均≤5μg/ml；非还原型SDS-PAGE电泳后采用聚乙二醇染色测得游离PEG残留量小于15μg/ml；Lowry法测得蛋白质含量为1.0mg/ml±0.15mg/ml，考马斯亮蓝试剂法检测NaCNBH<,3>残留经方法学考察符合要求，且样品中无NaCNBH<,3>残留，小鼠引产试验表明，经过PEG修饰后的TCS引产活性加强。聚乙二醇化天花粉蛋白的鉴别实验中的免疫印迹和聚乙二醇染色均为阳性，还原SDS-PAGE法测得聚乙二醇化天花粉蛋白相对分子量为54KD±5.4KD，聚乙二醇化天花粉蛋白注射液成品是无色澄明的液体，无肉眼可见不溶物，装量不少于1.0 ml/支，符合《中国药典》三部附录Ⅰ A中对装量的要求。pH值为3.0～5.5，无菌实验、细菌内毒素检查均阴性符合成品注射剂检测规定要求。 综上所述，所建的质量控制标准可以有效控制和评价PEG-TCS的质量,PEG-TCS注射液成品的外观装量、理化性质、含量、有关物质残留、无菌实验、细菌内毒素含量、异常毒性实验等指标符合新药审批的技术要求。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

聚乙二醇修饰药物技术的研究进展（综述）

引言

第一部分试剂与仪器

1主要试剂材料

2主要仪器

第二章聚乙二醇化天花粉蛋白质注射液质控方法研究

1方法

1.1游离TCS的HPLC检测方法建立

1.2游离PEG残留检测方法的建立

1.3还原剂NaCNBH3残留检测方法建立

1.4蛋白含量测定Lowry法方法学的验证

1.5无菌实验验证

1.6细菌内毒素检查

1.7聚乙二醇化天花粉蛋白生物活性测定

2结果

1.1游离TCS的HPLC检测方法考察结果

1.2 PEG残留检测方法结果

1.3 NaCNBH3残留检测方法结果

1.4蛋白含量测定Lowry法方法学的验证

1.5无菌实验方法学验证

1.6细菌内毒素检查

1.7聚乙二醇化天花粉蛋白生物活性测定

3分析与讨论

第三章聚乙二醇化天花粉蛋白质量标准的建立

1 方法

1.1聚乙二醇化天花粉蛋白鉴别

1.2 聚乙二醇化天花粉蛋白的理化性质

1.3 聚乙二醇化天花粉蛋白的纯度检查

1.4 聚乙二醇化天花粉蛋白的蛋白含量

1.5 聚乙二醇化天花粉蛋白的引产活性

1.6 聚乙二醇化天花粉蛋白的安全评价

2 结果

2.1 聚乙二醇化天花粉蛋白鉴别

2.2 聚乙二醇化天花粉蛋白的理化性质检查

2.3 聚乙二醇化天花粉蛋白的纯度检查

2.4聚乙二醇化天花粉蛋白的蛋白含量

2.5聚乙二醇化天花粉蛋白的引产活性

2.6 聚乙二醇化天花粉蛋白的安全评价实验

3分析与讨论

第四章全文总结

1研究结果

2进一步研究方向

附聚乙二醇化天花粉蛋白注射液成品质量标准草案

参考文献

致谢

作者简介及在读期间发表的论文