除草剂炔草酯降解菌分离鉴定、降解特性及降解机理研究

摘要

炔草酯是一种芳氧苯氧丙酸类除草剂，全球销售额在芳氧苯氧丙酸类除草剂中排名第二。有研究表明炔草酯对哺乳动物有着致畸、致癌的风险。本研究以炔草酯为底物，对炔草酯降解微生物进行分离筛选，以期为炔草酯污染的生物修复提供理论基础和微生物资源支持。　　经过多轮富集驯化，从生产炔草酯的农药厂污水处理系统活性污泥中，成功得到了能够在7 d内完全降解炔草酯的菌群WP。利用UPLC-MS鉴定菌群WP降解炔草酯的中间产物主要有炔草酸、4-（5-氯-3-氟-2-吡啶氧基）苯酚、5-氯-3-氟2-吡啶酮，揭示了炔草酯通过细菌降解的完整代谢途径。　　通过对富集液中细菌进行分离纯化，并利用含有炔草酯的 LB 固体培养基，获得了4个能够降解炔草酯的菌株WP-18、WP-27、WP-38、WP-66。对这4个菌株降解炔草酯的能力进行测定，确定WP-66是一株炔草酯高效降解菌株。经过形态、生理生化试验及16SrRNA基因序列分析，将WP-66鉴定为Pseudoxanthomonas sp.，其最适生长温度和pH分别为37 ℃和8.0。　　菌株WP-66降解炔草酯的最适温度为37 ℃，最适pH为7.0；在此条件下， 5%接种量的菌株WP-66在15 h内可将100 mg·L-1炔草酯降解92.21%。同时在1%低水平接种量及500 mg·L-1高浓度炔草酯的环境中，菌株WP-66也能够很好的发挥降解作用。经UPLC-MS鉴定菌株WP-66降解炔草酯的产物为炔草酸，推测该菌株降解炔草酯的机理是通过其分泌酯酶使炔草酯中酯键断裂来发挥降解作用的。　　通过对菌株WP-66进行全基因组测序并进行基因功能注释，从中找到了5个可能参与炔草酯降解的酯酶基因。以pET29a（+）为载体，成功构建了其中一个酯酶基因est 5的表达载体pET29a-est 5，并将其在E.coli BL21（DE3）中实现了异源表达，表达的酶液能够在含炔草酯的固体平板上水解炔草酯形成透明圈，证明菌株WP-66降解炔草酯的机理是通过其分泌的酯酶来实现的。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1芳氧苯氧丙酸类除草剂简介及作用机理

1.1.1芳氧苯氧丙酸类除草剂简介

1.1.2 芳氧苯氧丙酸类除草剂作用机理

1.2炔草酯性质及其降解方式

1.2.1 炔草酯的性质

1.2.2 炔草酯的危害

1.2.3 炔草酯降解研究进展

1.3研究内容及意义

第2章 炔草酯降解菌的富集及分离鉴定

2.1材料与方法

2.1.1 样品

2.1.2 试剂与培养基

2.1.3 仪器设备

2.1.4 炔草酯降解菌的富集

2.1.5 炔草酯检测及降解产物鉴定

2.1.6 基于16SrRNA测序的复合菌群WP细菌多样性分析

2.1.7炔草酯降解菌群WP可培养微生物分离鉴定

2.1.8 炔草酯降解菌株的筛选

2.2结果与分析

2.2.1 炔草酯降解菌群WP的获得

2.2.2 菌群WP降解炔草酯代谢途径分析

2.2.3 基于16SrRNA测序的复合菌群WP细菌多样性分析

2.2.4 物种分类统计

2.2.5炔草酯降解菌群WP可培养微生物分离鉴定

2.2.6 炔草酯高效降解菌株的筛选

2.2.7 炔草酯代谢中间产物降解菌株的筛选

2.3 讨论

第3章 炔草酯降解菌WP-66的鉴定及降解特性研究

3.1材料与方法

3.1.1 菌株与试剂

3.1.2菌株WP-66的形态特征及生理生化鉴定

3.1.3菌株WP-66系统发育树的构建

3.1.4菌株WP-66种子液的制备

3.2结果与分析

3.2.1菌株WP-66的初步鉴定

3.2.2菌株WP-66系统发育树

3.2.3菌株WP-66生长特性

3.2.4 菌株WP-66以炔草酯为唯一碳源的降解曲线及降解产物鉴定

3.2.5 温度对菌株WP-66降解炔草酯的影响

3.2.6 初始pH值对WP-66降解炔草酯的影响

3.2.7 炔草酯初始浓度对菌株 WP-66降解能力的影响

3.2.8 接种量对菌株WP-66降解炔草酯的影响

3.3讨论

第4章 菌株WP-66基因组测序及水解酶基因的克隆表达

4.1 材料与方法

4.1.1 菌株、试剂及培养基

4.1.2菌株Pseudoxanthomonassp. WP-66全基因组测序

4.1.3 高效感受态细胞的制备

4.1.4 炔草酯水解酯酶基因的 PCR扩增及TA克隆

4.1.5 表达载体pET29a-est的构建

4.1.6 炔草酯水解酯酶基因的表达

4.2结果与分析

4.2.1菌株WP-66基因组测序与数据组装结果

4.2.2 菌株WP-66基因功能注释

4.2.3炔草酯降解酶基因的预测

4.2.4 炔草酯水解酯酶基因的 PCR扩增及T/A克隆

4.2.5 表达载体pET29a-est2和pET29a-est5的构建

4.2.6 表达菌株的活性测定

4.2.7 炔草酯水解酶est5的诱导表达

4.2.8诱导表达的粗酶液功能验证

4.3 讨论

第5章 结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果