氰氟草酯降解菌的分离鉴定、降解特性及降解机理研究

摘要

目前我国农药滥用造成的环境污染现象日益严重，微生物在治理农药污染中起着重要的作用。本研究对农药厂活性污泥中能够降解除草剂氰氟草酯的微生物进行分离鉴定，并对其降解氰氟草酯的特性和机理进行研究。本研究可为利用微生物高效修复氰氟草酯污染问题提供优良菌株和理论基础。　　本研究利用含有氰氟草酯的培养基，从农药厂活性淤泥中成功分离筛选出一株能够降解氰氟草酯的菌株WP-9。利用16S rRNA序列同源性分析和生理生化试验将菌株 WP-9 鉴定为鞘氨醇盒菌（ Sphingopyxis sp. ） ，其最适生长温度25℃，最适pH 7.0，最适盐浓度1%。　　通过单因素试验研究菌株降解氰氟草酯的特性，结果表明：菌株WP-9降解氰氟草酯的最适温度为30℃，最适pH为7.0；在该条件下，菌株WP-9在5 d内能够将100 mg/L的氰氟草酯降解到2.97 mg/L。菌株WP-9对氰氟草酯的降解能力与接种量成正相关，当接种量≥5%时，其对100 mg/L氰氟草酯的降解效果理想；氰氟草酯平均降解速率在初始浓度≤100 mg/L时，随着浓度的增加而呈指数增长，过高浓度的氰氟草酯（200 mg/L）将抑制WP-9对氰氟草酯的降解。　　利用UPLC/MS鉴定菌株WP-9降解氰氟草酯的产物为氰氟草酸和氰氟草酚，据此推测菌株WP-9降解氰氟草酯的机理为：菌株WP-9首先依靠分泌的酯酶使氰氟草酯丙酸与丁醇之间的酯键水解，然后氰氟草酸苯氧基与丙酸之间的醚键再水解形成氰氟草酚。通过对菌株WP-9进行全基因组测序与功能注释，推测了4个酯酶基因和1个脂肪酶基因，成功构建了2个酯酶基因Cest-3和Cest-4的表达载体，其在含有IPTG、Kan和氰氟草酯的平板上形成透明圈。Cest-4在E.Coli BL21（DE3）中主要以包涵体形式表达，通过纯化、复性和浓缩后，其在37℃下对氰氟草酯降解活性较弱。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 农药污染与治理

1.1.1 我国农药污染现状

1.1.2 农药污染的治理

1.2 氰氟草酯简介及其对生态环境的影响

1.2.1 氰氟草酯简介

1.2.2 氰氟草酯对生态环境的影响

1.3 氰氟草酯降解研究

1.3.1 氰氟草酯在环境中降解动态

1.3.2 氰氟草酯微生物降解研究进展

1.4 研究目的及意义

第2章 氰氟草酯降解菌株的分离与鉴定

2.1 材料

2.1.1 样品

2.1.2 主要仪器

2.1.3 培养基与试剂

2.2 方法

2.2.1 降解菌株的富集和分离

2.2.2 降解菌株鉴定

2.2.3 生长曲线及最适生长条件初步研究

2.3 结果与分析

2.3.1 氰氟草酯降解菌株的分离

2.3.2 菌株WP-9的鉴定

2.3.3 生长曲线及最适生长条件测定

2.4 小结

第3章 菌株WP-9对氰氟草酯的降解特性与降解机理

3.1 材料

3.1.1 培养基与试剂

3.1.2 仪器

3.2 方法

3.2.1 种子液制备

3.2.2 氰氟草酯含量检测

3.2.3 菌株WP-9以氰氟草酯为唯一碳源的生长与降解曲线

3.2.4 温度对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.2.5 pH对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.2.6 接种量对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.2.7 底物浓度对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.2.8 氰氟草酯降解产物鉴定

3.3 结果与分析

3.3.1 菌株WP-9降解氰氟草酯的检测

3.3.2 不同时间菌株WP-9对氰氟草酯降解的影响

3.3.3 温度对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.3.4 初始pH值对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.3.5 接种量对降解菌株WP-9氰氟草酯的影响

3.3.6 初始浓度对菌株WP-9降解氰氟草酯的影响

3.3.7 菌株WP-9降解氰氟草酯途径分析

3.4 小结

第4章 菌株WP-9基因组测序与功能注释

4.1 材料与方法

4.1.1 样品

4.1.2 基因组测序、组装

4.1.3 基因功能注释

4.1.4 COG/KOG分析

4.2 结果与分析

4.2.1 测序质量评估

4.2.2 基因组组装与基因预测

4.2.3 基因功能注释

4.2.4 COG分类

4.3 小结

第5章 氰氟草酯降解酶基因的克隆与表达

5.1 材料

5.1.1 菌株和质粒

5.1.2 培养基与试剂

5.1.3 主要仪器

5.2 方法

5.2.1 基因组DNA提取

5.2.2 基因引物设计与PCR扩增

5.2.3 目的基因的扩增

5.2.4 琼脂糖凝胶电泳及目的片段胶回收

5.2.5 pET-29a(+)质粒的提取

5.2.6 质粒双酶切

5.2.7 目的DNA片段与载体连接

5.2.8 感受态细胞制备

5.2.9 重组载体转化

5.2.10 表达菌株降解氰氟草酯检测

5.2.11 重组子诱导表达

5.2.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

5.2.13 表达产物的Western-blot检测

5.2.14 目的蛋白可溶性分析

5.2.15 重组表达蛋白的纯化

5.2.16 蛋白复性及酶活检测

5.3 结果与分析

5.3.1 目的基因PCR扩增及回收

5.3.2 目的基因的双酶切及回收

5.3.3 pET-29a(+)质粒的提取及双酶切

5.3.4 重组载体的构建

5.3.5 表达菌株降解氰氟草酯验证

5.3.6 目的基因在E.Coli BL21（DE3）中的表达

5.3.7 目的蛋白Western-blotting检测

5.3.8 目的蛋白可溶性分析

5.3.9 蛋白纯化及复性

5.3.10 Cest-4酶液活性检测

5.4 小结

第6章 结论

参考文献

附录Ⅰ 目的基因序列

致谢

攻读学位期间的研究成果