猪慢病毒载体pLL-Myc和pLL-Klf4的构建

摘要

近年来为避开伦理学争论，国内外学者通过病毒表达载体向小鼠皮肤成纤维细胞中导入四种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4，可使小鼠皮肤成纤维细胞重新编程，产生类似于胚胎干细胞的多能性细胞，建立诱导性多潜能干（induced pluripotent stem cells，iPS细胞）细胞系。
　　 本实验根据c-Myc和Klf4基因已知序列，设计合成c-Myc和Klf4引物，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获取编码猪的c-Myc和klf4基因片段，从胎猪生殖嵴中提取总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增得到猪c-Myc和Klf4基因，回收纯化；然后经限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切反应，以T4连接酶连接c-Myc、Klf4基因片段和T载体，转化感受态细菌DH-5α后经Amp筛选、PCR鉴定及基因测序鉴定重组克隆，测序结果证实c-Myc和Klf4基因与已知基因序列吻合；用限制性内切酶对目的片段和pLEGFP-N1载体进行双酶切，分别回收纯化，得到c-Myc、Klf4基因双粘片段和pLEGFP-N1双粘线性质粒，以T4连接酶将二者连接，经转化、筛选、挑菌、摇菌，通过菌体PCR扩增鉴定显示成功构建逆转录病毒表达载体pLEGFP-Myc、pLEGFP-Klf4；用限制性内切酶对pLEGFP-Myc、pLEGFP-Klf4和pLentiLox3.7载体进行酶切，分别回收纯化，将得到的酶切产物Myc-GFP、Klf-GFP和pLentiLox3.7用T4连接酶进行连接，经转化筛选，挑菌摇菌，通过菌体PCR扩增鉴定显示慢病毒表达载体pLL3.7-Myc和pLL3.7-Klf4构建正确；将重组菌体进行质粒小抽，得到重组质粒pLL-Myc、pLL-Klf4，转染293FT包装细胞，培养24小时后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。
　　 本实验旨在构建猪慢病毒表达载体pLL3.7-Myc和pLL3.7-Klf4，为进一步研究诱导产生猪的iPS细胞、揭示c-Myc和Klf4基因在生物发育过程中的作用奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

文献综述：iPS细胞与畜牧业发展

1 iPS细胞的研究概况

2 iPS细胞的生物学特征

3 iPS细胞在畜牧业生产中的应用

3.1遗传育种和品种改良

3.2转基因动物生产

3.3性别控制

4其他

4.1人源性动物模型生产

4.2重编程机理研究

5 尚需解决的问题

6 结语

引 言

材料与方法

1 试验材料

1.1实验动物及细胞株

1.2材料

1.3主要仪器设备

1.4实验试剂配制方法

2 实验方法

2.1目的基因猪cMyc、Klf4的克隆

2.2目的基因逆转录病毒表达载体的构建

2.3目的基因慢病毒表达载体的构建

2.4病毒包装及转染

实验结果

3.1 RT-PCR产物结果

3.2限制性内切酶酶切反应结果

3.3菌体PCR鉴定(T载体)

3.4测序结果

3.5菌体PCR鉴定(pLEGFP-N1载体)

3.6菌体PCR鉴定(pLentiLox3.7)

3.7重组质粒DNA的抽提浓度测定

3.8重组质粒pLL-Myc、pLL-Klf4转染293FT细胞

讨论

4.1聚合酶链反应

4.2 RT-PCR

4.3 c-Myc基因

4.4 Klf4基因

4.5病毒载体

4.6 DNA导入方法

结 论

参考文献

致谢

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