醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

摘要

醋酸甲孕酮（Medroxyprogesterone Acetate，MPA）是一种人工合成的激素，在畜牧业生产中，曾被用作动物生长促进剂。由于醋酸甲孕酮有致乳腺癌的作用，我国和欧盟已禁止在动物性食品生产中使用该药物。国内外已建立了很多理化方法检测动物性食品中残留的醋酸甲孕酮。虽然有些方法比较灵敏精确，但由于花费大、时间长、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。作为一种快速、灵敏、特异的方法，酶联免疫吸附测定正逐渐应用于药物的残留检测。本研究通过抗原的合成和抗体的制备，建立了MPA的ELISA测定方法。
　　 本文采用O-（羧甲基）羟胺法合成醋酸甲孕酮-3-（O-羧甲基）肟（MPS）半抗原。用二环己基碳化二亚胺偶联法分别将醋酸甲孕酮-3-（O-羧甲基）肟与牛血清白蛋（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联合成人工完全免疫原和包被抗原。用紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对人工抗原进行初步鉴定，确定偶联成功。分光光度法估算MPS-BSA、MPS-OVA中半抗原与载体蛋白的偶联比率，最后测MPS-BSA的偶联比为19：1；MPS-OVA偶联比为18：1。
　　 用人工合成的醋酸甲孕酮．牛血清白蛋白（MPA-BSA）作为抗原免疫BALB/C小鼠4次后，间接ELISA测定免疫小鼠体内的MPA抗体效价，取1只免疫效果最佳小鼠的脾细胞，在PEG作用下与SP2/0细胞融合，利用杂交瘤技术筛选得到2株稳定分泌醋酸甲孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C11A386和4C11G8H6。对这两株细胞的上清和腹水进行效价测定，其细胞培养上清效价分别为1：640和1：320，腹水效价分别为1：2.56×106和1：1.6×106。对两株单抗进行鉴定：杂交瘤细胞染色体数分别为99.64±1.5和99.35±1.5，其分泌的抗体亚型均为IgG2a。将两株细胞经体外传代和多次冻存复苏后，其抗体分泌稳定。
　　 利用4C11A386杂交瘤细胞株的腹水单抗建立检测醋酸甲孕酮残留的间接竞争ELISA方法。绘制出醋酸甲孕酮间接竞争ELISA检测方法的标准曲线：y=-30.022LogC+90.191，R2=0.9911，此方法可测定的最适范围为1～100ng/mL；ciELISA检测显示其IC50为22ng/mL。在可测定范围内，孔雀石绿、无色孔雀石绿、己烯雌酚、四环素、恩诺沙星、呋喃唑酮、呋喃西林、氯霉素、青霉素等可能会因为同时使用而导致共同残留的药物未显示交叉反应性，表明该单抗具有较好的敏感性和特异性。
　　 本研究通过将MPA转化为人工抗原，免疫小鼠，成功地制备出了醋酸甲孕酮抗血清和单克隆抗体，为研制拥有我国自主知识产权的醋酸甲孕酮残留免疫检测试剂盒提供了一个良好的技术平台。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、论文出现的中英文缩写词

声明

文献综述

1动物性食品中兽药残留现状

2动物性食品中兽药残留的原因

3食品动物兽药残留的主要危害

4各国关于动物性食品中兽药残留的规定及控制

5兽药残留的检测方法

6醋酸甲孕酮概况及危害

7醋酸甲孕酮检测方法研究进展

8兽药小分子人工抗原合成研究进展

引 言

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1实验动物

1.1.2试剂与仪器

1.2试验方法

1.2.1醋酸甲孕酮免疫原的合成

1.2.2人工抗原的鉴定

1.2.3 MPA多抗制备

1.2.4醋酸甲孕酮单抗的制备

1.2.5醋酸甲孕酮单抗的鉴定

1.2.6醋酸甲孕酮竞争ELISA方法的建立

2结果与分析

2.1人工抗原鉴定

2.1.1 MPA-3-(O-羧甲基)肟(MPS)质谱分析

2.1.2人工抗原紫外扫描

2.1.3偶联物蛋白浓度的测定

2.1.4偶联物中半抗原与载体蛋白结合比的估算

2.1.5人工抗原及载体SDS-PAGE凝胶电泳

2.2多抗血清抗体效价和特异性测定

2.2.1多抗血清效价测定

2.2.2多抗特异性分析

2.3细胞融合及亚克隆

2.4醋酸甲孕酮单抗的鉴定

2.4.1杂交瘤细胞染色体分析

2.4.2单抗亚型分析

2.4.3杂交瘤细胞株的稳定性及抗体效价

2.5醋酸甲孕酮竞争ELISA方法建立结果

2.5.1包被抗原和一抗工作浓度的确定

2.5.2包被条件的确定

2.5.3封闭液的选择

2.5.4封闭时间的选择

2.5.5抗原抗体温育时间的确定

2.5.6底物作用时间的确定

2.5.7醋酸甲孕酮单抗50％抑制质量浓度的测定

2.5.8醋酸甲孕酮单抗特异性鉴定

3讨论

3.1完全抗原的制备

3.2醋酸甲孕酮完全抗原的定性定量分析

3.3偶联比的选择

3.4免疫程序及对抗体产生的影响

3.5细胞培养

3.6阳性细胞克隆化

3.7阳性克隆筛选

3.8抗原抗体最佳工作浓度的确定

3.9关于封闭条件的确定

4结论

参考文献

附录A.主要试剂配制

致 谢

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