无色孔雀石绿单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

摘要

孔雀石绿（MG）是一种抗寄生虫和抗细菌类药物，广泛应用于水产养殖业，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病等，并获得了极佳的效果。由于MG及其代谢产物无色孔雀石绿（LMG）在水产动物体内具有明显的高残留、高毒性、致癌、致畸、致突变等副作用，该药在动物食品中的残留问题已经引起了人们的高度重视，许多国家都将MG列为水产养殖禁用药。
　　 目前，国内外建立了理化分析和微生物方法，如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相-荧光检测法（HPL-CFLD）等，但因设备昂贵和检测效率低，而无法适合于规模筛选。间接竞争性酶联免疫法（ciELISA），具有快速、准确和无污染等优点，已经被广泛运用于药物残留的分析，获得高质量的单克隆抗体（McAb）是实现免疫分析的核心。与多克隆抗体（PcAb）相比较，McAb具有特异性强、均质性好、易于标准化等优势。国外已有成套的MG及其代谢物LMG的ELISA试剂盒上市，但我国用于MG检测的ELISA试剂盒主要依赖进口。因此，本研究对探索制备高质量的McAb，为自主研制ELISA试剂盒打下良好基础。
　　 本试验用人工合成的无色孔雀石绿．牛血清白蛋白（LMG-BSA）作免疫抗原，分别免疫6～8周龄健康BALB/c小鼠。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂有弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。四免以后，小鼠血清ciELISA效价均达到1：10000以上，小鼠产生较高效价的抗体，证明合成的LMG-BSA免疫原性较好，能使机体产生较强的免疫应答。
　　 采用50％ PEG作为促融剂，将免疫脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合后3～5d，可见呈葡萄状分布的融合细胞小集落克隆，细胞数多少不等。经鉴定：本试验获得的杂交瘤细胞染色体数目为99.12±3.6，小鼠脾细胞的染色体数目为40，而SP2/0骨髓瘤细胞为62.24±2.8条，说明2E6细胞株确实为SP2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的杂交细胞。细胞融合率为86.32％，其中单个细胞克隆分泌抗体阳性率为4.56％。经过对杂交瘤细胞的筛选和克隆化，共获得6株杂交瘤细胞株，从中筛选出1株效价高、特异性强的稳定分泌LMG单克隆杂交瘤细胞株，命名为2E6。经过3次亚克隆，克隆阳性率达100％。经多次冻存及复苏，杂交瘤细胞仍能保持稳定的抗体分泌能力。
　　 用ciELISA测定显示LMG50％抑制质量浓度为20.39ng/mL，诱生小鼠腹水的抗体效价达1：2.3×106。采用ciELISA计算出2E6 McAb与各种化合物的交叉反应率，结果表明，2E6 McAb与参与测试的2种同类药物MG、LMG有交叉反应率，对参与测试的其他5种水产养殖中常见禁用激素和抗菌药物已烯雌酚、氯霉素、副品红、甲基兰、四环素无任何交叉反应性。表明本试验获得的McAb具有较好的敏感性和特异性，为试剂盒的研制打下了基础。

目录

文摘

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论文说明：图表目录

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附录

文献综述

1食品中兽药残留现状

2孔雀石绿残留与分析

2.1孔雀石绿概况

2.2 MG的应用

2.3 MG的残留

2.4 MG的危害

2.5 MG的残留检测分析

引言

1材料与方法

1.1试验动物及细胞系

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4单克隆抗体的制备

1.4.1小鼠免疫

1.4.2小鼠血清抗体效价和特异性测定

1.4.3双向免疫扩散法测定小鼠多抗

1.4.4细胞准备

1.4.5细胞融合

1.4.6阳性细胞孔的筛选

1.4.7阳性孔细胞的克隆化

1.4.8杂交瘤细胞染色体记数

1.4.9单抗型及亚型鉴定

1.4.10 LMG 50%抑制质量浓度的测定

1.4.11 McAb特异性鉴定

1.4.12杂交瘤细胞的冻存

1.5腹水的制备与纯化

1.5.1腹水的制备

1.5.2腹水的纯化

1.5.3腹水特异性分析

1.6酶标板的选择

1.6.1酶标板均匀度的比较

1.6.2酶标板结合率的比较

1.7最佳包被原、抗体工作浓度的确定

1.8 ciELISA法的建立

1.9 ciELISA法条件的优化

1.9.1包被时间和条件的确定

1.9.2封闭液条件的确定

1.9.3抗原抗体作用时间的确定

1.9.4抗体工作液pH值的选择

1.9.5底物作用时间的确定

1.10 ciELISA方法灵敏度分析

1.11添加回收率的测定

1.11.1样品中LMG的提取

1.11.2固相萃取净化样品

2结果与分析

2.1小鼠多抗血清效价和特异性

2.1.1多抗血清效价测定

2.1.2特异性分析

2.2双向免疫扩散法测定抗体效价测定

2.3细胞融合及杂交瘤细胞筛选

2.3.1融合细胞的观察

2.3.2细胞融合筛选杂交瘤细胞株的稳定性及抗体效价

2.4单抗亚型分析

2.5杂交瘤细胞染色体计数：

2.6 LMG McAb 50%抑制质量浓度的测定

2.7 LMG McAb交叉反应率

2.8纯化腹水蛋白浓度测定

2.9腹水效价测定

2.10腹水特异性分析

2.11酶标板的均匀度和结合率

2.12包被原和抗体工作浓度的确定

2.13 LMG间接竞争ELISA法条件的优化

2.13.1包被时间的确定

2.13.2封闭液条件的确定

2.13.3抗原抗体温育时间的确定

2.1 3.4抗体工作液pH值的选择

2.13.5底物作用时间的确定

2.14 ciELISA方法灵敏度分析

2.15添加回收率测定

3讨论

3.1动物免疫

3.2细胞融合

3.3饲养层细胞

3.4阳性细胞克隆化筛选

3.4.1筛选时间

3.4.2筛选方法

3.4.3抗体效价测定

3.5交叉反应率

3.6酶标板的选择

3.7 ELISA方法灵敏度

3.7.1包被原的确定

3.7.2抗体浓度的确定

3.7.3封闭液和封闭时间的选择

3.7.4抗原抗体温育时间的确定

3.7.5抗体工作液pH值的选择

3.7.6底物作用的时间

3.7.7洗涤

3.8 ELISA方法特异性

3.9样品前处理

3.10研究意义

3.11 McAb研究前景

4结论

参考文献

致谢

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