Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究

目录

声明

第一章 绪论

1.1 Akkermansia muciniphila的基本特性和生物学功能

1.1.1 Akkermansia muciniphila在肠道中的分布及特征

1.1.2 Akkermansia muciniphila在宿主健康中的作用

1.1.3 Akkermansia muciniphila与免疫系统

1.2 分泌型黏蛋白Muc2

1.2.1 Muc2结构、功能与肠道内稳态

1.2.2 Muc2与肠道相关疾病

1.3 结直肠癌（CRC）

1.3.1 CRC简介

1.3.2 CRC与TRAIL相关的凋亡途径

1.3.3 ROS与CRC

1.4 立题依据和研究内容

1.4.1 立题依据

1.4.2 研究内容

第二章 重组蛋白Amuc-1434的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究

2.1 前言

2.2 实验用品

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验材料

2.2.3 实验试剂

2.2.4 实验溶液

2.3 实验方法

2.3.1 重组质粒的转化

2.3.2 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化

2.3.3 重组蛋白的纯化

2.3.4 纯化蛋白浓度的测定

2.3.5 Western blot鉴定纯化蛋白

2.3.6 纯化蛋白活性的测定

2.3.7 重组蛋白Amuc-1434动力学反应的测定

2.3.8 重组蛋白Amuc-1434浓度对酶促反应速率影响的研究

2.3.9 重组蛋白Amuc-1434最适反应pH和温度的测定

2.3.10 重组蛋白Amuc-1434温度稳定性的测定

2.3.11 抑制剂对重组蛋白Amuc-1434活性影响的研究

2.3.12 金属离子对重组蛋白Amuc-1434活性影响的研究

2.3.13 点突变对重组蛋白Amuc-1434活性影响的研究

2.4 实验结果

2.4.1 重组蛋白Amuc-1434诱导条件的优化

2.4.2 重组蛋白Amuc-1434的纯化及Western blot鉴定

2.4.3 重组蛋白Amuc-1434的活性测定

2.4.4 重组蛋白Amuc-1434动力学检测

2.4.5 重组蛋白Amuc-1434浓度与酶促反应速率的关系

2.4.6 重组蛋白Amuc-1434的最适pH 值

2.4.7 重组蛋白Amuc-1434的最适反应温度和热稳定性

2.4.8 几种蛋白酶抑制剂对重组蛋白Amuc-1434活性的影响

2.4.9 金属离子对重组蛋白Amuc-1434活性的影响

2.4.10 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG的纯化

2.4.11 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG活性测定

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体的制备、对Muc2的降解及其在肠道中表达位置的研究

3.1 前言

3.2 实验用品

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验材料

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验溶液

3.3 实验方法

3.3.1 抗原的处理

3.3.2 抗血清的制备

3.3.3 抗血清效价检测

3.3.4 抗血清特异性检测

3.3.5 HPLC检测抗血清纯度

3.3.6 细胞培养

3.3.7 贴壁细胞总蛋白的提取

3.3.8 Dot-blot检测蛋白间相互作用

3.3.9 Sandwich ELISA 免疫分析

3.3.10 Western blot实验

3.3.11 细胞黏附实验

3.3.12 Muc2降解实验

3.3.13 免疫荧光实验

3.3.14 组织切片的制作

3.4 实验结果

3.4.1 重组蛋白Amuc-1434抗体效价的评估

3.4.2 重组蛋白Amuc-1434抗体特异性和纯度的检测

3.4.3 重组蛋白Amuc-1434与Muc2相互作用

3.4.4 重组蛋白Amuc-1434对Muc2表达细胞的黏附作用

3.4.5 重组蛋白Amuc-1434降解Muc2

3.4.6 蛋白Amuc-1434在BALB/c小鼠肠道中的表达位置

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 重组蛋白Amuc-1434对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究

4.1 前言

4.2 实验用品

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验材料

4.2.3 实验试剂

4.2.4 实验溶液

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养

4.3.2 MTT

4.3.3 细胞周期实验

4.3.4 细胞凋亡实验

4.3.5 ROS水平检测

4.3.6 线粒体膜电位检测

4.3.7 细胞凋亡相关蛋白表达水平的检测

4.4 实验结果

4.4.1 重组蛋白Amuc-1434抑制LS174T细胞增殖

4.4.2 重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响

4.4.3 重组蛋白Amuc-1434诱导LS174T细胞凋亡

4.4.4 重组蛋白Amuc-1434增加LS174T细胞内ROS含量

4.4.5 重组蛋白Amuc-1434引起LS174T细胞线粒体膜电位下降

4.4.6 重组蛋白Amuc-1434 影响LS174T 细胞凋亡相关蛋白的表达

4.5 讨论

4.6 小结

结论

参考文献

作者简介及科研成果

致谢