乳链菌肽抗性蛋白突变体的表达对乳链菌肽产量的影响

摘要

乳链菌肽(nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的含有34个氨基酸的阳离子抗菌多肽，属于第一类羊毛硫细菌素，可有效抑制包括多种食物腐败菌和病原菌在内的革兰氏阳性菌，并可被人体产生的a-胰凝乳蛋白酶有效降解，对人体安全无毒，是目前唯一大规模商业化应用的高效天然食品防腐剂。
　　 在nisin产生菌中，nisin的抗性（免疫）是由nisI编码的脂蛋白(NisI)和nisFEG编码的ABC转运蛋白复合体(NisFEG)共同决定的；然而，在一些不产nisin的L.lactis中，nisin抗性则是由nisin抗性基因（nisin resistance gene，nsr）编码的一个分子量约为35kDa的nisin抗性蛋白(NSR)决定的。本研究通过基因工程的手段，采用定点突变的方法将nisin抗性基因nsr进行突变，并对突变后的抗性基因编码的蛋白生理功能进行了研究，根据其特有的生理功能又将该突变体蛋白在nisin产生菌中进行克隆与表达。研究取得了如下结果：
　　 1)nisin抗性基因nsr的定点突变：对基因nsr编码蛋白NSR的保守结构域进行分析，发现其第236位丝氨酸在所有末端特异性蛋白酶中均保守，可能为其活性中心。因此将NSR第236位丝氨酸突变为丙氨酸(记为NSRS236A)。
　　 2)抗性蛋白突变体NSRS236A的生理功能研究：本文构建了表达NSRS236A的L.lactis MG1363重组菌株，用以研究该蛋白的生理功能。Western blot杂交结果显示，和NSR一样，NSRS236A特异性定位于细胞膜上；肽释放实验表明突变体NSRS236A不再具备有降解nisin的功能；表面等离子共振检测表明NSRS236A能与nisin结合。
　　 3)NSRS236A的表达对nisin产量的影响：利用nisin抗性蛋白突变体NSRS236A可以结合nisin分子而不会对其行使降解功能的特点，将带有强组成型启动子P59的抗性基因nsr S36A克隆到nisin表达质粒pHJ201上，将重组质粒引入L．lactis NZ9800中，使nsr S36A基因得以表达，比较重组菌株L.lactis NZ9800/pHM582与对照菌株L.lactis NZ9800/pHJ201的生长曲线、对nisin的抗性水平、抑菌活性及nisin产量的差异。结果表明NSRS236A的表达对重组菌的生长速度没有明显的影响，但却能促使重组菌株对nisin的抗性水平提高40％，对指示菌Mflavus NCIB8166抑菌活性在6h和8h时明显增强，nisin的表达量分别提高1.9倍和27％。
　　 本项研究结果突出地表现在：定位于细胞膜上的NSRS236A通过结合细胞表面nisin分子，在细胞表面阻止nisin对自身菌体的破坏，增强了菌体对nisin的抗性水平，提高了nisin的表达量。
　　 以上结果说明nisin抗性蛋白突变体NSRS236A的表达可以提高产生菌对nisin的抗性，从而提高nisin产量，为通过基因工程手段提高nisin产量提供了新的途径。