玫烟色棒束孢几丁质酶Ⅱ基因的克隆、表达及两种几丁质酶的诱导转录

摘要

虫生真菌作为农林生态系中昆虫的重要致死因子，具有显著的流行潜力，对维持生态平衡具有重要作用。有些虫生真菌已被开发为真菌杀虫剂，进而广泛地应用于防治农林害虫。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea作为一类较为常见的虫生真菌，世界性分布，可寄生鳞翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目等多类昆虫。玫烟色棒束孢在北美和欧洲已被用于温室害虫的生物防治，目前已有真菌杀虫剂产品登记注册用于温室粉虱、蚜虫、蓟马和介壳虫的防治。
　　 前人研究表明，虫生真菌中常常存在多个几丁质酶，但各自在侵染中的作用主次尚未阐明。本课题组在先前的研究中，克隆获得了一个玫烟色棒束孢的几丁质酶Ifuchit1。在本研究中，我们运用RT-PCR和DNA步移技术从玫烟色棒束孢中又分离得到了一种新的几丁质酶基因Ifuchit2，序列已递交国际权威基因数据库GenBank登录，序列号为HQ267382。该基因全长1584bp，5′端非翻译区111bp，3′端非翻译区有202bp,开放阅读框(ORF)1272bp，编码423个氨基酸。信号肽长度为22个氨基酸。其编码蛋白理论分子量为46.57kDa，理论等电点为5.169。423个氨基酸中含强碱氨基酸37个（K，R），强酸氨基酸48个（D，E），疏水氨基酸150个（A，I，L，F，W，V），极性氨基酸119个（N，C，Q，S，T，Y）。通过Blast对保守区进行预测,发现该几丁质酶基因含有几丁质的活性位点（DGIDIDWE）和结合区域（SIGG），属于糖基水解酶18家族。
　　 又运用特异性PCR扩增和DNA步移技术，分别从玫烟色棒束孢中克隆得到几丁质酶的基因组序列和上游序列。结构基因总长1425bp，扩出的结构基因DNA与其cDNA比较含有三个内含子，分别位于距离起始密码子的121碱基至176碱基处，277碱基至331碱基处和380碱基至431碱基处，大小分别为54bp，53bp，51bp。在玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2结构基因的基础上，克隆得到了其上游序列。该基因上游序列大小为1794bp（序列号：JF323024），其中有209bp与该基因cDNA序列相互重叠。序列分析表明，玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2上游序列中，含有真核生物基因典型的TATA-盒，以及多个高度保守的潜在转录因子结合位点，如Oct1、GATA-1、GATA-2、CdxA等。另外，该上游序列还存在一些特异的应答元件，如热激应答元件（HSE）、胁迫应答元件（STRE）等。
　　 将克隆获得的玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2基因连接到分泌性表达载体pPIC9K 上后，通过电转化，转入毕赤酵母GS115。经甲醇诱导144h，离心收集上清，测定酶活37.3U/ml。将表达后的几丁质酶粗酶液，通过80％硫酸铵蛋白沉淀，离心收集沉淀，并用50mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解后，在相同的缓冲液中透析24h，离心弃沉淀。酶液经DEAE-Sepharose柱进行蛋白纯化。将具有活性的收集液采用PEG20000进行浓缩。最后以SDS-PAGE凝胶检测该蛋白，得到分子量为46kD左右，与预测的结果（46.57kDa）及相关报道结果相接近。
　　 玫烟色棒束孢RCEF3304菌株在粉状几丁质为诱导物的条件下，经12h，36h，60h 诱导后，提取总RNA。同时根据几丁质酶Ifuchit2基因和几丁质酶Ifuchit1基因序列设计引物，利用Realtime-PCR荧光检测技术比较两种几丁质酶基因在诱导前后自身转录水平以及两者之间表达量变化的差异，结果表明两种几丁质酶基因经诱导后，转录量均有所提高，且几丁质酶Ifuchit1的基因无论在诱导前还是诱导后，转录表达量都明显高于Ifuchit2，两者的表达量相差大约十几倍。因此，我们推测这两种几丁质酶属于诱导性酶，且Ifuchit1可能是玫烟色棒束孢几丁质酶类的主效基因，在菌株侵染过程中起主要作用。

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第一章 文献综述

第二章 引言

第六章 结 论

参考文献

致 谢

作者简介与攻读硕士学位期间发表的学术论文