同步检测头孢类抗生素与链霉素胶体金免疫层析法的建立

摘要

头孢类抗生素和链霉素都具有抗菌谱广、杀菌能力强的特点，因而在兽医临床上被广泛应用于治疗禽畜细菌感染等疾病，这两类药物又经常联用以增强治疗效果，这样增加禽畜机体内药物的残留，通过食物链蓄积在人体内，给人类的健康造成严重的危害。因此，为减少这两类药物残留对人健康的危害，必须要加强对动物源性食品中这两类药物残留的检测，建立一种灵敏度高，操作简便的方法具有十分重要的意义。
　　 1.人工抗原的合成及多克隆抗体的制备
　　 选取7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、头孢拉定(CED)、头孢氨苄(CEX)采用戊二醛法分别与牛血清蛋白(BSA)相结合制备免疫抗原、与卵清白蛋白(OVA)偶联制备包被抗原。采用化学交联法将链霉素(SM)分别与BSA和OVA偶联制备免疫抗原SM-BSA与包被抗原SM-OVA。人工抗原经紫外扫描和SDS-PAGE蛋白电泳鉴定阳性，紫外光谱扫描法计算7-ACA-BSA、CED-BSA、CEX-BSA以及SM-BSA结合比分别为14.34、15.62、12.29、15.21。用此四种抗原免疫新西兰白兔得到抗血清，经过ELISA测定抗血清效价，抗7-ACA-BSAIgG、抗CED-BSAIgG、抗CEX-BSAIgG以及抗SM-BSAIgG的效价分别为：12800、64000、64000、64000。结果表明：偶合成功，结合比恰当。所得抗血清效价符合实验要求。
　　 2.抗体交叉反应性的测定
　　 经过优化建立了间接ELISA的检测方法，通过交叉反应性的测定筛选出抗CEX-BSAIgG对头孢类药物有较好的交叉反应性，交叉反应率达到53.4％～101％，而抗SMIgG对硫酸链霉素及双氢链霉素有较好的交叉反应性交叉反应率达到85％～101％。链霉素与头孢类抗生素之间的交叉反应率却小于0.1％。因此选择抗CEX-BSAIgG为研制检测头孢类抗生素试纸条的抗体。
　　 3.金标抗体的制备及单一检测试纸条的制备
　　 将纯化后的抗体蛋白与制备的粒径为18nm的胶体金相结合制备成金标蛋白，并且对试纸条的组成材料和各条件进行优化后，将试纸条各组分按顺序组装好，并对试纸条性能进行测试，头孢氨苄检测试纸条在PBS和牛奶基质中对头孢氨苄的最低检测限分别为10ng/mL和80ng/mL，在牛奶基质中对其他头孢类抗生素的最低检测限都在500ng/mL之内；链霉素检测试纸条在PBS和牛奶基质中对链霉素的最低检测限分别为150ng/mL和400ng/mL，牛奶基质中对硫酸链霉素和双氢链霉素的最低检测限在1000ng/mL以内。表明研制的试纸条的特异性和灵敏度等性能基本符合检测要求。
　　 4.双元检测试纸条的组装及性能测定
　　 将头孢类抗生素及链霉素双元检测免疫层析试纸条组装好，其在PBS及牛奶基质中对头孢氨苄的最低检测限分别为20ng/mL和100ng/mL，对链霉素的最低检测限分别为200ng/mL和500ng/mL。在牛奶中对其他β-内酰胺类抗生素的最低检测限都在1000ng/mL之内；对双氢链霉素和硫酸链霉素的检测最低检测线都在1000ng/mL之内。表明研制的双元检测试纸条基本符合生产中用于检测这两类药物残留的要求。