布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

摘要

本研究拟应用胶体金免疫层析法(GICA)研制牛布鲁氏菌病诊断试剂条,以期用于布鲁氏菌病的快速检测,尤其是基层畜牧兽医站对本病的初筛.本文拟建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法.以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原，利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法，制备不同粒径的胶体金颗粒，并使用透射电镜及紫外一可见光谱对制备的金颗粒进行鉴定。筛选金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)为胶体金标记抗原的最佳pH值及SPA与蛋白最佳标记量，制备胶体金免疫层析试纸条，检测绵羊血清中布鲁氏菌特异性抗体、大肠杆菌及粪肠球菌中的特异性抗体，并验证所制备的试纸条的特异性、敏感性、重复性与稳定性。以粒径为40 nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高，使用透射电镜及紫外一可见光谱结果表明制备的胶体金颗粒大小均一、呈圆形，其尖峰出现在519nm处且峰型狭窄，制备的胶体金粒径均一。胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。试纸条最低可检出羊布鲁氏菌标准阳性血清1:200。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应，特异性高。试纸条检测结果与琉红平板试验方法的符合率为92%。用该试纸条检测绵羊布鲁氏菌20份阳性血清((SAT确认)，阳性率为100%;整个过程在10 min内准确读出结果;本试纸条在4℃可保存6个月。制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点，可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫，并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染，可在基层推广使用。