植原体免疫膜蛋白Imp的原核表达及多克隆抗体制备

摘要

植原体免疫主导膜蛋白(Imp)是植原体免疫膜蛋白系统中重要的成员，在植原体传播、致病的过程中可能起着关键的作用。对植原体膜蛋白组的研究，可探寻植原体致病机理，另通过免疫获得植原体各膜蛋白特异性抗体可制备高通量蛋白质检测芯片。本实验开展了原核诱导表达Imp，亲和层析纯化目的蛋白以及Imp多克隆抗体制备等一系列工作。
　　 本研究以重组克隆质粒pMD18-T-imp为模板，利用含NdeI、XhoI酶切位点的引物PCR扩增Imp基因片段，构建重组表达载体pET-28a(+)-imp，转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒pET-28a(+)-imp构建成功。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析，重组菌BL21(pET-28a(+)-imp)表达出大小约20kD的蛋白，与预期的携带6×HisTag的目的蛋白(19.5KD)大小相符。Westernblotting检测HisTag，结果显示带有6×HisTag的Imp融合蛋白在大肠杆菌中能够成功表达。可溶性分析显示，表达的Imp融合蛋白在大肠杆菌体系内以可溶蛋白和包涵体两种形式存在，主要为包涵体蛋白。
　　 重组菌BL21(pET-28a(+)-imp)培养条件正交实验结果表明，最佳培养条件参数为：温度37℃，pH7.0，装液量20％。重组菌培养8h达到稳定期。根据方差分析，一定的范围内，培养温度对重组菌生长影响最显著，各因素影响主次为：温度>装液量>pH。诱导条件正交实验结果表明，最佳诱导条件组合为：温度37℃，起始OD600≈1.5，IPTG终浓度0.1mmol/L，诱导培养6h。根据方差分析，诱导温度与诱导起始OD600值对Imp的表达量影响最显著，各因素影响主次为：诱导温度>诱导起始OD600值>诱导时间>IPTG终浓度。实验结果显示诱导物IPTG与目的蛋白表达对重组菌的生长产生影响，菌体的生长量与融合蛋白的表达量呈线性相关。以优化条件发酵重组菌，融合蛋白Imp的表达量约为70mg/L。
　　 原核表达载体pET-28a(+)表达的融合蛋白带有6×HisTag，Ni-NTAHis-Bind树脂作为亲和材料纯化融合蛋白Imp。200ml发酵菌体裂解液与1ml的树脂结合，使用8ml含40mM咪唑的洗涤缓冲液可除去绝大部分杂蛋白，4ml含300mM咪唑的洗脱缓冲液可基本洗脱目的蛋白。研究表明以包涵体为材料，变性条件下纯化获得较高浓度与纯度的Imp蛋白。纯化的可溶性蛋白透析脱咪唑，浓缩获得0.8mg/mlImp蛋白溶液，纯度>95％。将纯化的融合蛋白免疫家兔后，成功获得了兔抗Imp多克隆抗体。间接ELISA法测定抗体效价为1:128，000，Western-blotting分析制备的多克隆抗体与Imp蛋白发生特异性反应。