鸡AvBD7成熟肽在大肠杆菌中的表达及抗菌活性分析

摘要

AvBD7成熟肽是一种拥有42个氨基酸残基的鸡β-防御素，属于阳离子抗菌多肽(Cationicantimicrobialpeptides，CAMPs)，是鸡体内先天性和获得性免疫的重要成分。它具有抑菌谱广、抗菌力强且不易使病原微生物产生抗药性等优点，是一种具有非常良好应用前景的“抗生素替代品”，如何对其进行大规模生产应用已成为目前的研究热点。
　　 为了探索鸡β-防御素在大肠杆菌表达系统中的表达水平及体外抑菌活性情况，本研究以鸡AvBD7作为研究对象，应用基因工程技术，将人工合成的AvBD7成熟肽基因克隆并插入载体pGEX-6P-1中，构建成功重组的pGEX-6P-AvBD7大肠杆菌工程菌。通过优化表达条件获得大量的可溶性融合蛋白GST-AvBD7，用Prescission蛋白酶切除GST标签并纯化得到的鸡AvBD7成熟肽具有较好的抗菌活性。具体研究内容和结果如下：
　　 1.构建表达AvBD7成熟肽的大肠杆菌工程菌
　　 根据GenBank中登记的鸡β-防御素序列(登录号DQ858344)人工合成鸡AvBD7成熟肽基因序列，设计1对引物P1(5′端含有EcoRI酶切位点)和P2(5′端含有SalI酶切位点)用于PCR扩增鸡AvBD7成熟肽基因片段，把PCR扩增出的鸡AvBD7成熟肽基因片段和pGEX-6P-1载体分别进行双酶切后连接，构建成功pGEX-6P-1-AvBD7成熟肽表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)。
　　 2.鸡AvBD7成熟肽的表达、纯化及鉴定
　　 将测序正确的E.coliBL21(DE3)/pGEX-6P-AvBD7接种于LB液体培养基(Amp终浓度为100μg/ml)，经IPTG诱导表达出GST-AvBD7融合蛋白，SDS-PAGE检测分子量约为31kD。为了提高蛋白的可溶性表达量，经过摸索不同的表达条件发现，在16℃120rpm/min经0.1mmoL的IPTG诱导约24h后可溶性融合蛋白GST-AvBD7得到最佳表达。将GST-AvBD7融合蛋白经过亲和层析、超滤、C18ZipTip层析后进行MALDI-TOF-MS质谱分析，MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定出蛋白分子量为5516Da，此分子量与形成2个二硫键的AvBD7成熟肽的理论分子量相符。
　　 3.鸡AvBD7成熟肽的抗菌活性分析
　　 采用打孔扩散法检测纯化得到的鸡成熟肽AvBD7对各个指示菌的抑菌情况，结果发现：纯化得到的鸡成熟肽AvBD7对黄色微球菌(NCIB8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠链球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(CMCC44102)都有抑菌活性。但是，鸡β-防御素AvBD7成熟肽对白色念珠菌(ATCC10231)和白色念珠菌(ATCC90029)无抑菌作用。用BCA蛋白检测试剂盒测纯化得到的鸡AvBD7成熟肽(质谱分析鉴定正确)的蛋白浓度，再根据Levengood等人的方法测量纯化得到的鸡AvBD7成熟肽对不同指示菌的最小抑菌浓度(MIC)，结果显示：对黄色微球菌(NCIB8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠链球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(CMCC44102)的最低抑菌浓度分别为16.875、67.5、67.5、135mg/L；用纯化得到的高浓度(>540mg/L)鸡AvBD7成熟肽对两株真菌白色念珠菌(ATCC10231)和白色念珠菌(ATCC90029)进行最低抑菌浓度实验发现没有抑菌活性产生。由此可知，体外条件下纯化得到的鸡β-防御素AvBD7成熟肽只对一些特定的指示菌具有抑菌活性。
　　 本研究构建成功重组的pGEX-6P-AvBD7大肠杆菌工程菌，经过优化表达条件使融合蛋白GST-AvBD7的可溶性表达量达到最大，对表达纯化得到的重组AvBD7成熟肽进行质谱分析，再通过琼脂打孔扩散法检测AvBD7成熟肽的体外抑菌活性和2倍稀释法测定对指示菌的最低抑菌浓度。这些研究结果丰富了我们对防御素的认识，也为新型饲料添加剂的开发提供了实验数据。