HPLC-ELSD测定茶树可溶性糖含量及GS基因的克隆与表达

摘要

茶树作为我国重要的经济作物,低温引起的伤害一直是我国茶叶优质高产的限制因素。茶树原产于热带及亚热带,抗寒力弱,而随着我国茶区的逐渐北移和极端气候频繁发生,预防低温对茶树的伤害及选育抗寒性强的品种对茶树稳产和北方地区的引种都有较大的意义。低温逆境中,茶树体内会发生一系列的生理和生化变化,而且相关受低温调节的基因也会被诱导表达。
　　本研究选取“皖茶91”、“乌牛早”、“平阳特早”、“龙井43”四种茶树为试验材料,利用高效液相色谱-蒸发光散射技术(HPLC-ELSD)对越冬期间茶树体中主要的可溶性糖(蔗糖、棉子糖、果糖和葡萄糖)的含量进行分析。这一期间内茶树体内可溶性糖含量的动态变化分析结果表明,茶树的叶片和根系中可溶性糖含量变化一致,随着温度的降低,蔗糖、果糖、葡萄糖含量大幅度增加,且均在1月份达到最大值,2月开始逐渐下降。而棉子糖从11月开始被检测到,含量随温度降低有所上升。因此,推测出糖含量增加幅度大的品种抗寒性较强。
　　上述试验中,根据棉子糖含量的特殊变化,进一步对调控棉子糖合成的关键酶---肌醇半乳糖苷合成酶(GS)及其编码基因进行研究,将有助于从分子水平上研究糖代谢与茶树抗寒性的关系。因此,从Genebank中获得一条GS基因的EST片段,通过RACE技术克隆得到茶树GS基因,命名为CsGS,其cDNA全长1321bp,开放阅读框861bp,编码287个氨基酸,分子量为33.34 kDa,登录号为JQ639791。通过对CsGS基因的上游调控序列相关分析,发现该基因中含有多种低温胁迫诱导相关转录因子的顺式作用元件。通过越冬期间对茶树GS基因的qRT-PCR分析表明,低温能够诱导GS基因的表达,且在当年生成叶中相对表达水平较高,其次是老叶,在根中表达最低。其表达水平在11月至次年1月间显著上调。因此,推测CsGS基因催化合成了棉子糖家族寡糖(RFOs),其在组织中的表达受到严格控制,在茶树的低温逆境中起保护作用。

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图表清单

1 引言

1.1 茶树抗寒生理的研究现状

1.2 茶树抗寒分子机制的研究现状

1.3 可溶性糖在植物代谢调节中作用的研究现状

1.4 研究目的与意义

1.5 研究内容与技术路线

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 仪器与试剂

2.3 试验方法

3 结果与分析

3.1 自然越冬期间茶树体内可溶性糖含量的动态变化

3.2 肌醇半乳糖苷合成酶GS的全长cDNA克隆与序列分析

3.3 GS基因的荧光定量表达分析

4 讨论

4.1关于越冬期茶树体内可溶性糖成分检测结果的讨论

4.2 关于越冬期间茶树根系中可溶性糖含量变化结果的讨论

4.3 关于越冬期间茶树体内棉子糖检测结果的讨论

4.4 GS的全长克隆和序列分析结果的讨论

4.5 越冬期间GS基因的qRT-PCR表达分析结果的讨论

4.6 茶树中GS基因上游调控序列分析

5 结论

参考文献

致谢

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成 果 清 单