鸭坦布苏病毒Real Time RT-PCR监测方法的建立及跨种间传播的初步研究

摘要

自2010年4月以来,在我国东南地区省份的部分鸭场中先后爆发了一种急性传染病,主要引起蛋鸭产蛋急剧下降。鸭群患病后4~5d左右产蛋率可从80％~85%迅速下降至10%~30%,甚至停产;发病率60%~100%。临床剖检以卵巢变性、出血、萎缩,肝脏有白色针尖状坏死等为典型病变。该病最初在江苏、浙江等地发生,之后在河北、山东、安徽、福建、广东等省份的大部分鸭群中迅速蔓延开来,给我国养殖业造成巨大的经济损失。经病毒分离及基因测序,现已确定该病原为鸭源坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)。
　　本研究为建立一种针对DTMUV的快速、敏感、特异的Real-Time RT-PCR诊断方法,首先根据DTMUV安徽分离株AH-10株E基因序列为模板(GenBank登录号:JQ957513)设计特异性引物,将E基因全长克隆至具有T7启动子的载体pBSK上,经测序无误后以该质粒为模板,在T7RNA聚合酶作用下合成E基因RNA序列,将该RNA提纯后作为Real-Time RT-PCR的标准品模板。在E基因中间再设计一对特异性引物用于PCR扩增,使用荧光嵌合染料SYBR GreenⅠ,通过对反应体系及反应条件的优化,最终本研究建立起一种特异性高,敏感性强的DTMUV一步法Real-Time RT-PCR检测方法。该方法最低可检测到20拷贝的病毒核酸,比普通RT-PCR高1000倍以上,且以其他常见禽病病原核酸作为模板无非特异扩增,具有良好的特异性。
　　临床样品检测显示,普通RT-PCR样品阳性检出率为35.1%(59/168),Real-Time RT-PCR方法检出率为73.8%(124/168);动物回归实验检测结果,普通RT-PCR阳性样品总检出率为30.2%(29/96),Real-Time RT-PCR方法阳性总检出率为64.6%(62/96),表明该实验建立的Real-Time RT-PCR检测方法明显高于普通RT-PCR。本研究为DTMUV感染的临床诊断提供了一种快速、敏感、特异的诊断方法,同时也为DTMUV的流行病学及分子生物学研究提供必要的技术支持。
　　为探索新发鸭坦布苏病毒是否具有跨物种感染人的能力及可能存在的致病性,本研究以Balb/c小鼠作为哺乳动物模型,第一次动物试验分别以105、104、103TCID5剂量病毒分别通过腹腔及颅内接种方式感染小鼠,感染后每天观察记录小鼠体重变化及发病情况,直至小鼠完全死亡或康复。重复进行上述动物试验,在发病转归期处死各组半数小鼠,分离血清,对此时血清中DTMUV总抗体水平及特异性IgG及IgG亚类进行检测,同时采集肝、肾、脾、脑,对这些脏器中病毒含量进行检测,以此来分析DTMUV感染小鼠后引起的小鼠天然免疫应答以及病毒在组织中的增殖情况。另外,为了探究DTMUV对哺乳动物是否存在抗体依赖增强作用(ADE),本试验对腹腔接种方式感染14天后的小鼠进行病毒的二次腹腔接种途径感染,观察小鼠的临床症状,在小鼠发病最严重时处死小鼠,对其血清中特异性IgG及脏器中病毒含量进行检测,分析DTMUV对小鼠的抗体依赖增强作用,最后并对该试验现象进行验证。
　　结果显示,DTMUV以颅内接种方式感染小鼠时候,病毒可在小鼠的组织脏器中进行增值,尤其以脑组织中病毒含量最高,病毒核酸最高可达3000~4000copies/mg;脾脏中病毒含量仅次于脑,肝脏中病毒含量最低约800~600copies/mg。感染小鼠还表现为体重降低、采食废绝,脑部有轻微出血等症状,同时该病毒感染后小鼠还产生高水平的中和抗体,其中105TCID50剂量组中IgG及IgG2a浓度可达100μg/mL以上,而104TCID50及103TCID50剂量组显著低于105TCID50剂量组。另外,DTMUV对小鼠有明显的抗体依赖增强作用,二次感染后4天小鼠表现出严重的发病症状,并可在其组织中检测到约350~1000copies/mg的病毒核酸,特异性IgG含量也极显著高于二次感染前水平。
　　研究结果表明DTMUV具有一定的跨物种传播引起哺乳动物发病的能力,并且该病毒可对哺乳动物产生抗体依赖增强作用。然而DTMUV是否具有潜在的跨种间传播感染人类的可能性尚需进一步的研究一旦该病毒在宿主细胞中找到合适的受体,或该病毒在自然进化的过程中某些关键位点的氨基酸发生了特定的变异,很有可能会导致病毒突破种属间传播的屏障引起人类的感染。

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文 献 综 述

1 引 言

2 材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结 果

3.1病毒分离

3.2 DTMUV RT-PCR鉴定

3.3 E基因的扩增及克隆

3.4 RNA标准品的制备

3.6 特异性分析

3.7 敏感性分析

3.8 重复性分析

3.9 One Step Real Time RT-PCR样品检测

4 讨 论

4.1 Real Time PCR在黄病毒检测中的应用

4.2 One Step Real Time RT-PCR方法在DTMUV检测中的优越性

4.3 DTMUV对小鼠的致病性

4.4 关于DTMUV抗体依赖增强作用的初步研究

5 全文结论

参考文献

致谢

个 人 简 历

研究生期间发表论文及申请专利