柞蚕模式识别受体PGRP-A的序列分析及重组表达

摘要

昆虫的免疫系统与脊椎动物不同,它没有T细胞和B细胞,没有脊椎动物所具有的补体系统。尽管它没有获得性免疫系统,但是却具有可以对病原微生物做出快速和有效应答的先天性免疫系统。肽聚糖识别蛋白(PGRP)是重要的先天性免疫基因家族,是一种重要的模式识别受体,它可以识别微生物表面的肽聚糖(PGN)并启动免疫反应。迄今为止,在多种昆虫和其他动物中都发现了PGRP,尽管这些PGRP在进化过程中,结构上表现的很保守,但是在功能和表达模式方面确是不一样的。
　　柞蚕(Antheraeapernyi)是鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的一种绢丝类昆虫,除了作为纺织工业原料利用外,还有很高的药用和食用等经济价值。为了能够更全面的了解PGRP在鳞翅目昆虫先天性免疫中的功能,本实验以柞蚕为研究对象,克隆鉴定出一种肽聚糖识别蛋白,将其命名为PGRP-A,利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕PGRP-A基因进行研究,获得的主要结果如下:
　　1.PGRP-A基因的克隆及序列分析:
　　设计简并性引物,经PCR克隆扩增获得了1个新基因PGRP-A的全长序列。该序列全长961bp,包括由40个核苷酸组成的5’端非编码区(5’UTR)、由582个核苷酸组成的开放阅读框(ORF)编码193个氨基酸,以及由339个核苷酸组成的3’端非编码区(3’UTR)。其中,编码氨基酸的预测分子量大小为22.0kDa,等电点为7.368。构建系统进化树分析表明柞蚕PGPR-A氨基酸序列与印度柞蚕PGRP的同源性最高。
　　2.PGRP-A基因的表达分析:
　　采用PCR方法扩增了柞蚕PGRP-A的ORF,并连接至表达载体pET-28a(+),然后将重组质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,用不同浓度的IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE和Westernblotting检测,结果表明重组蛋白在大肠杆菌中得到了稳定的表达,并用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,为下一步研究其功能奠定了基础。

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1 文 献 综 述

1.1 昆虫的先天免疫

1.2 模式识别受体（PRRS）

1.3 肽聚糖识别蛋白研究进展

2 引 言

2.1 研究的目的及意义

2.2 主要研究内容

2.3 技术路线

3.1 实验材料

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

4 结 果

4.1 柞蚕的总 RNA 的检测

4.2 柞蚕PGRP-A基因序列的测定和分析

4.3 柞蚕PGRP-A与其他昆虫PGRP的同源性分析

4.4 原核表达载体的构建

4.5 重组蛋白的原核表达及纯化

4.6 Western blotting 检测

5 讨 论

5.1 柞蚕蛹注射和柞蚕成虫注射的区别

5.2 柞蚕PGRP-A基因全长与序列分析

5.3 柞蚕PGRP-A的原核表达和Western Blotting

6 结 论

参考文献

致谢