柞蚕溶菌酶基因在酵母中的表达及重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌的作用

摘要

本文研究的目的：(1)建立柞蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统；(2)筛选柞蚕溶菌酶酵母表达菌株；(3)纯化表达的柞蚕溶菌酶；(4)分析重组柞蚕溶菌酶糖基化性质；(5)确定重组柞蚕溶菌酶N端氨基酸序列；(6)检测重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌的抗菌活性。 柞蚕溶菌酶基因cDNA克隆到酵母表达载体pPIC9K中BamHI和EcoRI位点上，载体中原有的信号肽序列(α-Factorsignal)被柞蚕溶菌酶自身的信号肽序列所取代。pPIC9K-ApLZ重组质粒DNA用BglⅡ酶切，使其线性化，并用电转化方法将其导入毕赤酵母菌GS115(His4)中。在含有4mg/mlG418的YPD培养基上选出高拷贝的转化菌株。利用MM和MD培养基进一步确定所选出的高拷贝菌株的表型，留下表型为His+Muts的菌株。利用含有溶壁微球菌的YPM固体培养基从表型为His+Muts的酵母菌株中筛选出柞蚕溶菌酶高表达菌株。分析柞蚕溶菌酶表达菌株的表达时相，酵母菌在BMMY培养基中，30℃下摇瓶培养6天，每24小时加甲醇至终浓度0.5﹪，以保持蛋白分泌表达，柞蚕溶菌酶的表达在甲醇诱导后的96小时达到高峰。在200ml的BMMY培养上清液中，加硫酸铵至终浓度60﹪(w/v)沉淀分泌表达的柞蚕溶菌酶，并用装有阳离子交换凝胶CMSepharoseCL-6B的2x20cm的柱子进一步纯化柞蚕溶菌酶，50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)/0.5M氯化钠溶液用于洗脱样品。15﹪SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳确定纯化的柞蚕溶菌酶分子量约20，000道尔顿，大于预测的13，986道尔顿。为分析蛋白质的糖基化性质，纯化的柞蚕溶菌酶用Endo-H酶处理，经Endo-H酶水解的柞蚕溶菌酶分子量小于未经酶处理的柞蚕溶菌酶。蛋白质N端氨基酸序列分析结果显示纯化的柞蚕溶菌酶的N端氨基酸序列为KWFTK。用琼脂扩散法检测重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌的抗菌活性，结果表明重组柞蚕溶菌酶能够抑制变形链球菌的生长。 研究结论，建立了柞蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统。使用柞蚕溶菌酶自身的信号肽序列，柞蚕溶菌酶在毕赤酵母细胞中得到正确表达并有效地将成熟柞蚕溶菌酶分泌到酵母细胞外。柞蚕溶菌酶在酵母菌中的表达是在0.5﹪甲醇诱导下，培养96小时达到高峰。纯化的重组柞蚕溶菌酶分子量约为20，000道尔顿，其N端氨基酸序列为KWFTK，与预测的成熟柞蚕溶菌酶序列一致。EndoH酶解结果证实，重组柞蚕溶菌酶是经过糖基化修饰的，低聚糖以N-链形式附在柞蚕溶菌酶上。重组的柞蚕溶菌酶对变形链球菌有抑制其生长的作用。

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讨论

结论

参考文献

附图

综述 龋病防治的研究进展

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