植物(豆芽)吡哆胺—吡哆醛转换反应作用酶的分离纯化及表征

摘要

维生素B6(VB6)是一类吡啶化合物的总称,游离型为吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxine,PM)和吡哆醛(Pyridoxal,PL),三者相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)。其中PLP是VB6的主要辅酶形式,参加催化涉及氨基酸的各种代谢反应,在其他多种物质的合成和代谢过程中也发挥着重要作用。
　　PM-丙酮酸转氨酶(Pyridoxamine-Pyruvate aminotransferase,PPAT)催化PM和PL之间的相互转化,它以PM和丙酮酸为底物生成PL和L-丙氨酸,同时谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)在脱掉PLP辅基的条件下也可以催化PM和PL的相互转化,这些分别在微生物和动物中被发现证实,植物体内也存在PM和PL的相互转化,但作用酶及其酶的性质还不明确。
　　本论文首先对豆芽中的GOT进行分离纯化,粗酶液经过两次硫酸铵分段沉淀、两次Sephadex G-100凝胶过滤柱层析、两次DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析等分离纯化技术,GOT被纯化了200.8倍,通过对纯化酶的底物特异性分析,发现GOT全酶并不能催化PM和丙酮酸反应生成PL和丙氨酸,只有在脱PLP辅基(pH2.7)的条件下,才能催化PM和草酰乙酸反应生成PL。
　　对豆芽中的GOT进行纯化分析后,再对豆芽中的PPAT进行分离纯化,通过两次硫酸铵分段沉淀、两次Sephadex G-100凝胶过滤柱层析、两次DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析等分离纯化技术,对新鲜豆芽中的吡哆胺-丙酮酸转氨酶进行分离纯化,经SDS-PAGE电泳检测,样品呈现单一条带。研究结果表明:该酶被纯化了207.56倍,得率为7.84％;通过底物特意性分析发现:以PM和丙酮酸为底物时,PPAT表现出最大活性,可见此酶具有很强的专一性;PLP既不能促进也不能抑制其反应的进行;因转氨酶的转氨反应机制都属于乒乓反应机制,因此采用乒乓反应机制对两步转氨反应进行研究,所以在最适反应条件下,以吡哆胺和丙酮酸为反应底物时测得酶的Km值分别为:1.7765mmol/L和5.3335mmol/L。这对进一步研究植物体内VB6代谢机制奠定了基础。

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1 文献综述

1.1维生素B6(Vitamin B6, VB6)简介

1.2 植物体内VB6的从头合成途径

1.3 植物体内VB6的补救途径

1.4 PM到PL转换途径作用酶

1.5 PPAT的概述

2引言

2.1 研究的目的和意义

2.2 研究内容

3 材料与方法

3.1 实验材料、仪器及试剂

3.2 实验方法

4 结果与分析

4.1 豆芽GOT的分离纯化效果

4.2 GOT的纯度鉴定

4.3 纯化后的GOT和不同底物反应的活性测定

4.4 辅基PLP的释放量对GOT和不同底物反应的影响结果

4.5 豆芽PPAT的纯化效果

4.6 PPAT纯度鉴定

4.7 PPAT部分酶学性质的研究

5 讨论

5.1 GOT的分离纯化

5.2 GOT的底物特异性

5.3 PLP辅基对GOT在VB6代谢过程中影响

5.4 PPAT的分离纯化

5.5 PPAT的最适温度、pH及其稳定性

5.6 PPAT的动力学常数

6 结论

6.1 GOT的分离纯化

6.2 GOT的底物特异性

6.3 PLP辅基对GOT在VB6代谢过程中影响

6.5 PPAT的最适温度、pH及其稳定性

6.6 PPAT的动力学常数

6.7 PPAT的底物特异性

参考文献

致谢

9作者简介

10研究生期间发表的论文