植物(烟草)吡哆胺—吡哆醛转换反应作用酶的分离纯化及表征

摘要

维生素B6(VB6)是一种水溶性维生素,游离型为吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)和吡哆醛(Pyridoxal,PL),相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)。其中PLP是VB6的主要辅酶形式,参加催化涉及氨基酸的各种代谢反应,在其他多种物质的合成和代谢过程中也发挥着重要作用。
　　PM-丙酮酸转氨酶(PPAT)和PM-草酰乙酸转氨酶可以催化PM与PL之间的相互转化反应,同时,谷草转氨酶(GOT)在脱去辅酶PLP后,可以催化PM与PL之间的转化反应,但是这些都只是在微生物和动物中被证实,植物中同样存在PM与PL之间的相互转换,但是作用酶尚不明确。
　　烟草作为一种模式植物,广泛用于植物生理生化的研究。本文以烟草为材料,对烟草体内的GOT和PPAT进行分离纯化,为植物体内VB6的代谢途径的研究奠定基础。
　　本文采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤等步骤,对烟草GOT进行纯化,结果显示:GOT被纯化了102.66倍。GOT为PLP依赖型酶,本文研究表明PLP存在时GOT并不催化以吡哆胺为底物的转氨反应,但去除PLP后,GOT可以催化以吡哆胺和草酰乙酸为底物的转氨反应;而以L-天冬氨酸和a-酮戊二酸为底物时,GOT活性随PLP释放量增大而减小,这与动物中GOT的性质相同。
　　因此本文采用同样的纯化方法对烟草PPAT进行纯化,并对其酶学性质进行了分析。结果显示:PPAT被纯化了82.79倍。以PM和丙酮酸为底物,纯化最后一步的PPAT酶液仍表现出较大活性,可初步认定植物体内,催化PM与PL之间的相互转换的转氨酶为PPAT。对PPAT的部分酶学性质分析发现β-巯基乙醇和EDTA会抑制酶活力,其中β-巯基乙醇几乎使酶失活,酶促反应的Vmax为4.545μmol·L-1·min-1,PM和丙酮酸Km值分别为2.465μmol·L-1和1.537μmol·L-1。

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1 文献综述

1.1维生素B6简介

1.2 植物VB6的从头合成途径

1.3 植物VB6的补救途径

1.4 PM与PL相互转换代谢酶

2 引言

2.1 课题研究的目的和意义

2.2 研究内容

3 材料与方法

3.1 材料、仪器和试剂

3.2 试验方法

4 结果与分析

4.1 烟草GOT分离纯化及酶学性质分析

4.2 烟草PPAT分离纯化及酶学性质分析

5 讨论

5.1 GOT与PPAT的分离纯化

5.2 GOT和PPAT的最适温度和最适pH

5.3辅酶PLP及不同底物对GOT酶活的影响

5.4不同蛋白酶保护剂对PPAT活性的影响

6 结论

6.1 GOT的分离纯化

6.2 GOT最适温度和最适pH

6.3 辅酶PLP及不同底物对GOT酶活的影响

6.5 PPAT最适温度和最适PH及PH稳定性

6.6 不同蛋白酶保护剂对PPAT活性的影响

6.7 GOT和PPAT动力学常数(Km)的测定

6.6 PM-PL代谢途径转氨酶确定

参考文献

致谢

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研究生期间发表的论文