纳米微粒载NF-κB圈套基因作用精神分裂症动物模型研究

摘要

目的： (1)制备纳米微粒基因载体，探讨其结合、保护DNA的优势。 (2)分析精神分裂症模型动物NF-κB介导的细胞因子变化，从免疫学方面探讨精神分裂症的病理机制。 (3)探讨纳米微粒载NF-κB圈套基因作用于精神分裂症模型动物后对NF-κB介导的细胞因子的干预效果。 方法： (1)运用乳化聚合法通过单因素试验结合正交分析优化制备条件，制作合适平均粒径PBCA纳米微粒，并对其进行表面改性，制备适合作为纳米微粒基因载体的纳米微粒。 (2)利用纳米微粒作为基因载体结合哑铃型NF-κB圈套基因，制成纳米微粒载NF-κB圈套基因。 (3)利用体重为350±20g雄性wistar大鼠，注射0.3mg/kg、0.6mg/kg、1.2 mg/kg、1.8 mg/kg、2.4 mg/kg不同剂量MK-801，观察实验动物的行为变化，优化模型制作的最佳剂量，建立精神分裂症动物模型。 (4)利用纳米微粒载NF-κB圈套基因通过侧脑室注射抑制NF-κB蛋白活性，考察动物在行为学上的变化，同时考察纳米微粒载圈套基因对TNF-α、IL1β、IL-2、IL-6、IL-10 mRNA表达的影响。 数据结果采用SPSS统计软件包处理。 结果： (1)单因素试验和正交试验确定制备平均粒径74±3nm纳米微粒(NP)的制备条件：反应溶液pH值为2.5，BCA单体浓度为1％，搅拌速度为1000r/min，表面活性剂为1％的Dextran70，添加0.3％的Tween-80，在25℃反应3h，调节pH值在6～7之间，继续搅拌1h终止。所制NP为均匀球形，表面平滑完整，粒径分布呈正态分布，分布均匀，跨度仅在0.21左右，分散良好。 (2)采用0.25％CTAB对空白PBCA-NP进行表面改性，Zeta电位从-23.0mV提高到+23mV。MTT 法测定细胞毒性，PBCA-NP 和CTAB-PBCA-NP 均在≤100ng/μl时没有表现出细胞毒性。 (3)经过表面改性的NP在pH值7.0条件下可以质量比10∶1与哑铃型NF-κB圈套基因结合，包封率为96.21％，结合后并未引起NP表面形态和平均粒径的改变。与NP结合以后基因片段抗DNase Ⅰ、血清降解，超声破坏的能力得到了显著的提高。 (4)经过剂量实验，注射剂量为0.6mg/kg，注射体积100bμl/20g可以诱发较为典型的精神分裂症症状，运动增加、刻板行为明显、存在一定程度的共济失调，社会行为淡漠。同时大鼠仍然保持一定的行为能力未出现中毒症状。 (5)纳米微粒载NF-κB圈套基因在动物实验中以较高的效能抑制了NF-κB的活性，与裸圈套基因相比有显著水平的差异(P=0.0324)。利用纳米微粒载NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠，抑制NF-κB的活性，表现出了较好的抑制效应。 (6)纳米微粒载NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠后大鼠的行为发生了显著的变化，MK-801诱导的运动加快、刻板和共济失调行为都低于对照组。其中对运动行为的影响下降了45％，影响达到了极显著水平(P=0.007)；刻板行为方面也达到了显著水平(P=0.046)。共济失调的改善也比较显著，达到显著水平(P=0.026)。 (7)纳米微粒载NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠后NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-10在mRNA水平的表达发生了变化，NF-κB、IL-10 表达上调，TNF-α、IL-1β、IL-2 表达下调，统计结果均有显著性差异。 结论： (1)乳化聚合法工艺可以制备粒径较小、分布均匀的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒。经阳离子表面活性剂CTAB修饰，做为理想的纳米基因载体，携载NF-κB圈套DNA可以较高效能抑制NF-κB的活性； (2)MK-801诱导的精神分裂症模型动物存在NF-κB功能的亢进和多种细胞因子的mRNA的表达的异常； (3)首次将纳米微粒结合基因片段应用于精神分裂症的病理研究，初步结论认为：纳米NF-κB圈套DNA作用于精神分裂症模型动物可以干预NF-κB介导的免疫激活，为研究精神分裂症与免疫系统的关系构建了新的研究平台； (4)应用纳米NF-κB圈套DNA作用于精神分裂症模型动物，可以部分逆转实验动物的诱导症状，证实NF-κB与精神分裂症模型动物的行为存在关联。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

前言

第一部分 聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒制备工艺及作为基因载体的研究

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3结果

1.3.1单因素实验初选PBCA-NP制备条件

1.3.2正交实验结果

1.3.3优化后的PBCA-NP制备条件

1.3.4优化条件制备PBCA-NP特性

1.3.5 Tween-80表面改性PBCA-NP的制备

1.3.6 CTAB处理Tween-80表面改性PBCA-NP的制备

1.3.7最终采用制作工艺

1.3.8哑铃型圈套DNA

1.3.9载DNA的CTAB-PBCA-NP粒度分析和透射电镜分析

1.3.10 pH值对CTAB-PBCA-NP与DNA结合能力的影响

1.3.11 CTAB-PBCA-NP与DNA混合比例对其结合能力的影响

1.3.12 NP对DNA保护性试验

1.3.13 CTAB-PBCA-NP毒性分析

1.4讨论

1.4.1基因载体

1.4.2纳米与纳米微粒

1.4.3 PBCA-NP

第二部分 纳米NF-κB圈套基因作用精神分裂症模型大鼠研究

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果

2.3.1 MK-801诱发大鼠产生类似精神分裂症症状最佳剂量的优化

2.3.2载NF-κB圈套ODNs的PBCA-NP效能分析

2.3.3纳米NF-κB圈套基因对精神分裂症模型大鼠NF-κB活性的影响

2.3.4纳米NF-κB圈套基因对精神分裂症模型大鼠行为的影响

2.3.5纳米NF-κB圈套基因对精神分裂症大鼠几种细胞因子mRNA表达的影响

2.4讨论

2.4.1精神分裂症动物模型的建立

2.4.2纳米NF-κB圈套基因对NF-κB活性的抑制

2.4.3纳米NF-κB圈套基因对MK-801诱导大鼠行为的影响

2.4.4纳米NF-κB圈套基因对MK-801诱导大鼠免疫异常的影响

结论

参考文献

综述 纳米药物载体在神经精神药理学方面的应用进展

致谢

攻读博士期间发表的学术论文及参见的研究