黄芪多糖对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的体外保护作用研究

摘要

本试验采用体外培养奶牛乳腺上皮细胞为试验材料，拟建立大肠杆菌内毒素(LPS)诱发奶牛乳腺上皮细胞的体外凋亡模型，在此基础上研究黄芪多糖对LPS诱发奶牛乳腺上皮细胞凋亡的保护作用;并探讨黄芪多糖对炎症时细胞及其分泌物中若干细胞因子和酶的变化规律。研究结果可为黄芪多糖等中草药作为免疫生理调节剂在动物乳腺炎防治应用中提供新思路，并为奶牛乳房炎的预防与治疗提供参考。
　　1.奶牛乳腺上皮细胞体外凋亡模型的建立
　　采用组织块培养法，建立体外奶牛乳腺上皮细胞培养体系，拟用LPS(0、10、20、50、100、200μg/mL)直接作用于第2代奶牛乳腺上皮细胞，设多个时间点(3、8、16、24h)，分别采用CCK-8、流式细胞仪、DNAladder条带法及电镜等试验技术方法，对乳腺上皮细胞活性、病理组织学变化、以及生物化学特性的变化，以出现细胞凋亡特异性标志为准则确定LPS诱导细胞凋亡的作用时间和作用浓度。试验结果表明，100μg/mL的LPS作用8h，建立的凋亡模型，为最理想的凋亡模型。
　　2.黄芪多糖对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的体外保护作用
　　为研究黄芪多糖对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的保护作用，以试验一建立的奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型为试验材料，将生长状态良好的乳腺上皮细胞进行分组试验，分别分为:空白对照组、LPS模型组、黄芪多糖+LPS模型组，其中黄芪多糖的浓度分别为:1、3和5 mg/mL，共分为五个试验组。采用CCK-8、流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳及透射电镜等试验技术方法进行各项指标测定，结果显示:与对照相比较，LPS组的细胞活性显著下降，与LPS组相比较，黄芪多糖各药物组的细胞活性显著增强，并呈剂量依赖性关系。黄芪多糖可显著的把凋亡的细胞阻滞在S期，从而促进细胞DNA合成的增加。提示黄芪多糖对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡具有拮抗保护作用。
　　3.黄芪多糖对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的调节及机制研究
　　为进一步探究黄芪多糖对奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的调节及机制，本试验采用放射免疫法测定黄芪多糖对炎症时细胞及其分泌物中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2细胞因子含量的变化规律，并用ELISA检测各种相关酶NAGase、AKP、MPO、iNOS的活性变化规律。试验结果显示，黄芪多糖在1、3、5 mg/mL的浓度下不会对奶牛乳腺上皮细胞产生毒性作用，且经黄芪多糖预处理后细胞及其分泌物中能够明显降低TNF-α、IL-1β、IL-6的含量及NAGase、AKP、MPO、iNOS活性显著降低。
　　以上试验结果表明，黄芪多糖可能够对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡起到拮抗保护作用，且其作用机制是通过抑制各种细胞因子的分泌，及降低各相关酶的活性，从而减少乳腺中嗜中性粒细胞浸润，减轻乳腺组织炎性损伤。

目录

声明

论文说明

摘要

引言

缩略词(Abbreviation)

第一章 文献综述

1 奶牛乳房炎概述

1．1 奶牛乳房炎的危害

1．2 奶牛乳房炎的病因及发病机制

1．3 奶牛乳腺炎的分类

1．4 奶牛乳腺炎的诊断

1．5 奶牛乳腺炎的治疗

2．奶牛乳腺上皮细胞天然的免疫防御机制及凋亡调控机制

2．1 乳腺上皮细胞天然的免疫防御机制

2．2 乳腺上皮细胞凋亡的调控机制

3．黄芪多糖免疫调节作用概述

3．1 抗肿瘤作用

3．2 对心肌和心血管系统的影响

3．3 抗氧化应激作用

3．4 免疫调节作用

第二章 LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞体外凋亡模型的建立

1．试验设备与试剂

1．1 主要仪器

1．2 药品和试剂

2．试验方法

2．1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及纯化

2．2 CCK-8法检测乳腺上皮细胞活性

2．3 流式细胞术(Annexinv-FITC／PI)检测乳腺上皮细胞凋亡率

2．4 DNA Iadder检测凋亡细胞核酸的变化情况

2．5 电镜观察乳腺上皮细胞形态学变化

2．6 统计学分析

3．结果与分析

3．1 CCK-8法检测乳腺上皮细胞活性

3．2 流式细胞术(AnnexinV-FITC／PI)检测乳腺上皮细胞凋亡率

3．3 DNA Ladder检测凋亡细胞的结果

3．4 不同浓度LPS对乳腺上皮细胞形态学观察

4．讨论

5．小结

第三章 黄芪多糖对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的保护作用

1．试验设备与试剂

1．1 主要仪器

1．2 药品和试剂

2．试验方法

2．1 奶牛乳腺上皮细胞培养

2．2 细胞的分组及处理

2．3 CCK-8检测细胞存活率

2．4 流式细胞术检测乳腺上皮细胞周期的影响

2．5 琼脂糖凝胶电泳检测乳腺上皮细胞DNAladder条带

2．6 电镜观察细胞内部超微结构的变化

2．7 数据处理与统计分析

3 结果与分析

3．1 黄芪多糖对凋亡模型下奶牛乳腺上皮细胞的存活率的影响

3．2 黄芪多糖对凋亡模型下奶牛乳腺上皮细胞周期的影响

3．3 黄芪多糖对凋亡模型下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

3．4 黄芪多糖对凋亡模型下奶牛乳腺上皮细胞形态的影响

4．讨论

5．小结

第四章 黄芪多糖对乳腺上皮细胞炎症时炎性细胞因子及相关酶分泌的影响

1．试验设备与试剂

1．1 主要仪器

1．2 药品和试剂

2．试验方法

2．1 奶牛乳腺上皮细胞培养

2．2 细胞的分组及处理

2．3 检测各项指标

2．4 数据处理

3．结果与分析

3．1 黄芪多糖对奶牛乳腺上皮细胞分泌TNF-α、IL-β、IL-6、IL-2的影响

3．2 黄芪多糖对LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞分泌NAGase、AKP、MPO、iNOS的影响

4．讨论

5．结论

全文结论

参考文献

致谢

个人简介

攻读硕士研究生期间发表文章情况