细菌几个重要生物合成基因簇的异源克隆表达和功能研究

摘要

来源于细菌（特别是放线菌与粘细菌）的聚酮合酶(polyketidesynthases，PKS)或非核糖体肽合成酶(nonribosomalpeptidesynthetases，NRPS)能形成多酶复合体以顺序催化简单的小分子羧酸或氨基酸合成一类数目庞大，结构复杂多样且具有广泛生物活性的次生代谢产物，是新药的一个重要来源。然而这类细菌活性化合产物结构及立体化学的多样性严重限制了化学合成的有效产量，原始生产菌株的发酵生产也受到生长速度、培养条件及化合物产量获得等客观条件的制约，且该类化合物合成基因在染色体上呈线性排列，形成长达数kb大小的基因簇，使得受到内切酶位点和DNA片段大小限制的传统基因工程操作技术在细菌工程菌构建的操纵过程中缺乏优势。因此，利用先进的分子生物学技术，将次级代谢途径从原始生产菌株转移至合适宿主中异源生产预期的次级代谢产物逐渐成为微生物药物化学领域研究的热点。　　发明于上一世纪末的新型Red/ET同源重组技术能利用Reda/Redp或RecE/RecT重组酶的配合作用，将两端带有同源臂(35～100bp)的供体DNA分子直接重组到靶DNA分子上，实现对靶标DNA快速、精确、高效的修饰，这一给基因工程领域带来又一场重大变革的新技术在操纵PKS-NRPS基因簇过程中展现了独特的优势，因而成为了本研究主要采用的分子技术方法。　　本研究首先以来源于橙色标桩菌（Stigmatellaaurantiaca）的黄色色素MyxochromideS为研究对象，利用Red/ET同源重组方法将mchs基因簇克隆进p15A-oriV-apr质粒，并分别以Pm和PtetR启动子启动其表达。两重组质粒通过电转化法将转入异源宿主农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58后均成功进行MyxochromideS化合物的合成，通过对异源重组宿主菌产素水平的比较，Pm和PtetR启动子异源表达功能得到了扫描，也一并开发出农杆菌这一表达多聚酮类化合物的优良异源宿主。随后通过PCR在p15A-oriT-BSD骨架两端添加同源臂，我们利用一步调取整个基因簇的直接克隆(Direcloning)技术，成功的将来源于纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum）长约56kb的埃博霉素基因簇进行克隆，将整个epo基因簇插入到两个IR之间并引入oriT-Tpase盒式元件，简化了对大片段DNA进行修饰的步骤，为方便的进行大片段基因簇的接合转移及整合进异源宿主染色体提供了新思路。对epoK基因在异源宿主菌中不工作的原始启动子进行替换，换以假单胞菌通用强启动子Psyr，使epo基因簇在恶臭假单胞杆菌（Pseudomonasputida）中表达产生了多种埃博霉素衍生物，为埃博霉素的工业制备提供可能。最后本研究再次利用直接克隆技术及Red/ET方法，将丁香假单胞菌（Pseudomonassyringaepv.Syringae）的sy1基因簇（全长22kb）克隆进p15A-oriT-Tpase-BSD质粒，在以链霉素通用启动子PsnpA替换其syl基因簇原有启动子之后，重组的syl基因簇被整合于天蓝链霉菌及变铅青霉菌的染色体上，所获得的两株异源表达工程菌均成功了合成出多种syringolin衍生物，RT-PCR及HPLS-MS实验检测结果显示该基因簇的各个基因均得到良好表达并成功合成了多种syringolin化合物。通过MTT实验检测，syringolin化合物在体外对黑色素瘤B16细胞、乳腺癌4T1细胞、纤维素瘤Meth-A细胞、宫颈癌Hela细胞均具有良好的抗肿瘤活性。对荷4T1、B16肿瘤小鼠的体内实验结果也显示该异源表达化合物对肿瘤生长抑制作用明显。为新型药物的开发及大规模发酵生产提供了可行的方法。　　本研究通过利用Red/ET同源重组技术对三种重要细菌生物合成基因簇进行克隆与异源表达的过程中，发展了“直接克隆”(Direcloning)的新技术。将目的基因插入到带有Tpase-oriT的表达载体，使得在一步进行从宿主基因组中精准调取目的基因簇的同时，目的基因簇得以通过接合转移整合到异源宿主染色体中进行表达，有效的节省了进行后期改造修饰的步骤及时间。本研究同时获得了分别成功表达次生代谢产物Mxyocromide、埃博霉素及syringolin的多株异源表达工程菌，其中埃博霉素与syringolin化合物为新一代抗癌药物的候选，对新药的开发及这两类化合物的生产、组合生物学合成及功能基因研究具有现实及实践意义。

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