磷氮霉素生物合成基因簇中的调控基因的功能研究及几个结构基因的改造

摘要

磷氮霉素(PNs，也称Phoslactomycins，PLMs)是一类具有抗真菌、抗肿瘤活性的聚酮类化合物，它除了具有蛋白磷酸化酶抑制剂的功能外，还对于黄瓜灰霉病菌有着良好的防治效果。本课题探索磷氮霉素的生物合成途径，通过分析宿主菌(StreptomycesplatensisSAM-0654)磷氮霉素生物合成的结构基因和调节基因，采用删除，添加，取代或重组等手段研究各基因的功能。
　　 首先补全了磷氮霉素生物合成基因簇。与StreptomycesHK803相比，之前所筛选得到的基因簇缺少与P450氧化酶相关的基因。通过设计P450基因的探针，筛选基因组文库得到到含有目标P450基因以及其他缺失基因的fosmid，补全了基因簇。
　　 其次研究了磷氮霉素生物合成基因簇中调控基因的功能。采用了三种方法。一是对删除了调控基因pnR2的突变株△pnR2做了回补。△pnR2突变体发酵不产生磷氮霉素(PNs)，表明pnR2基因是合成磷氮霉素的正调控基因。本文在构建了正确的pnR2回补质粒(pZJ1-19-1)后，通过接合转移的方式导入了△pnR2突变株mtR2中，所获得正确回补突变株命名为mZJhb-R2。对mZJhb-R2进行发酵培养可以产生磷氮霉素，其产量与野生型相比基本一致，证实pnR2是合成磷氮霉素的正调控基因。二是在野生型菌株中增加一个pnR2基因拷贝。将pnR2回补质粒pZJ1-19-1接合转移的方式导入了野生型菌株获得增加一个拷贝pnR2基因的突变株mZJ-R2-wt，对mZJ-R2-wt进行发酵培养可以产生磷氮霉素，其产量与野生型相比高将近一倍，再一次证实pnR2是合成磷氮霉素的正调控基因。三是用RT-PCR的方法研究了磷氮霉素生物合成基因簇中调控基因对合成磷氮霉素骨架有关的结构基因pn1、pn6、pn8以及后修饰基因pnT1表达量的影响。结果发现缺失调控基因pnR1的突变株mLW-R1和缺失调控基因pnR2的突变株mLW-R2，其pn1、pn6和pnT1的表达量都比野生生显著下降，而pn8的表达未见明显影响。实验还发现，在突变株mLW-R2中，调控基因pnR1没有表达。上述结果证明在磷氮霉素的生物合成基因簇中，位于ORF21的基因pnR1和位于ORF22的基因pnR2都是正向调控基因，调节某些结构基因的转录，同时，pnR2还调控pnR1的转录。
　　 第三，改造了几个结构基因，对起始功能域LD的替换和硫酯酶功能域TE的替换，但没有得到预期的实验结果。