磷氮霉素生物合成基因簇的克隆及功能研究

摘要

磷氮霉素（PNs，也称Phoslactomycins，PLMs）是由多种链霉菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤活性的一类多组分聚酮类化合物，因分子中含有磷酸基和氨基而得名。它们是蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的选择性抑制剂，有发展成为抗肿瘤药物先导或农用抗真菌生物农药的潜力。然而PNs的哺乳动物毒性限制了其作为农药的应用前景。基于此，本课题主要目标是克隆PNs生物合成基因簇，通过对PNs生物合成机制研究，阐明其独特酶催化反应机制，利用代谢工程和生物化学方法改造其化合物结构，获取PNs的“非天然”的天然产物类似物。希望发现生物活性保持或提高而毒性降低的PNs类似物，为新型生物农药的发现与开发奠定基础。 依据文献报道并优化发酵条件，使PNs的发酵产量稳定在较高水平；在E.coli ET12567和Streptomyces platensis SAM—0654之间建立了有效的接合转移遗传转移系统；同时采用pCClFos为载体构建了高质量基因组文库，效价达8000cfu/μgDNA。 根据已经报道的来源于Streptomyces HK803的PLMs生物合成基因簇同源基因设计简并引物：以S.platensis SAM—0654基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆得到一高同源性基因片段；以此基因片段标记探针对S.platensisSAM—0654基因组文库进行原位杂交筛选，并结合染色体步移技术得到了与PNs合成相关的完整生物合成基因簇。 通过测序共获得约100kb连续DNA序列，共包含40个开放阅读框架；推测其中的22个ORF与PNs的生物合成相关。这22个ORF包含了7个PKS基因，2个负责乙基丙二酰辅酶A合成基因，4负责环己酰辅酶A合成个基因，一个转运蛋白基因，6个后修饰基因，两个调控基因。在生物信息学分析基础上提出了PNs生物合成途径，并通过基因中断证实了该基因簇与PNs的生物合成相关性。 对比克隆到得S.platensisSAM—0654的PNs生物合成基因簇与文献报道的S.HK803中PLMs生物合成基因簇发现宿主菌产生产生同一化合物的生物合成基因具有较高同源性，但二者的前体生物合成基因和调控基因存在较大差异。借助于PCR—targrting方法致力于两个前体基因pnP5，pnP6及两个调控基因pnR1，pnR2的功能研究。 总之，PNs生物合成基因簇的克隆与功能研究及与PLMs生物合成基因簇对比提示同一化合物在不同宿主菌种可能有完全不同的调控机制，其进一步深入研究将推动PNs作为生物农药的开发和发展。 上述工作为开发磷氮霉在生产实践中的应用价值创造了条件。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

一、PNs的结构、生物活性及作用机制

二、PNs类化合物的化学合成

三、PNs的生物合成现状及其意义

四、课题的提出和意义

2材料与方法

一、材料

1.1菌株和质粒

1.2仪器

1.3培养基

1.4试剂

1.5溶液：

二、实验方法

2.1 DNA电泳及DNA片段的回收和纯化

2.2 DNA的酶切和连接

2.3大肠杆菌质粒的制备

2.4大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.5 PCR及PCR产物的克隆

2.6 S.SAM-0654基因组DNA的制备

2.7核酸分子杂交

2.8 S.SAM-0654和E.coli ET12567之间的属间接合转移

2.9 S.SAM-0654PNs发酵条件及检测方法

3结果与讨论

3.1发酵、遗传转移系统的建立及基因文库的构建

3.1.1 PNs发酵条件的建立

3.1.2 S.platensis SAM-0654的抗生素敏感性研究

3.1.3 S.platensis SAM-0654和E.coli ET12567之间的属间接合转移

3.1.4 S.platensis SAM-0654基因组文库的建立

3.2 PNs生物合成基因簇的克隆

3.3 PNs生物合成基因簇的分析及功能研究

3.3.1基因簇分析及对比

3.3.2部分基因功能的分析

3.3.3推测PNs的生物合成路线

3.3.4证明所克隆的基因与PNs的生物合成相关

小结

展望

参考文献

致谢

攻读学位期间科研成果及参加的科研项目