UMT作为红色荧光报告蛋白在大肠杆菌的功能和可溶性表达

摘要

尿卟啉原III甲基化酶（UMT）是血红素和西罗血红素分支合成途径的关键酶。重组UMT在细胞中积累催化的红色荧光物质西罗叶绿三酸和三甲基咕啉，所以UMT是一种新型荧光报告蛋白。与绿色荧光蛋白相比，UMT的应用研究报道较少。本文以大麦和玉米UMT作为报告蛋白，分别研究了不同条件对UMT以及UMT融合蛋白在大肠杆菌的表达水平，结果如下：
　　1.分析了定向进化的重组大麦UMT功能，和野生型蛋白相比，表达突变体的大肠杆菌细胞荧光强度增加。紫外可见光谱和荧光光谱扫描初步确定荧光物质为西罗叶绿三酸和三甲基咕啉。
　　2.探明了不同温度、IPTG浓度、启动子和不同菌株对表达两种大麦UMT的细胞荧光强度的影响。结果表明，不同条件下，突变体比野生型细胞荧光强度增加。
　　3.验证了两种大麦UMT融合不同标签后蛋白表达的变化。ssrA融合表达的突变体在胞内完全降解，而融合表达的野生型则聚集为包涵体；导肽pelB融合的野生型和突变体蛋白，和胞内表达相比，荧光降低。
　　4.分析了不同菌株、分子伴侣以及5-氨基酮戊酸（ALA）对玉米UMT融合的MBP和TEVp突变体蛋白可溶性表达的影响。在不同菌株中，融合蛋白的荧光强度趋势一致；共表达分子伴侣对细胞荧光强度无显著影响；添加外源ALA则影响了TEVp及其突变体融合蛋白的荧光强度。
　　5.分析了玉米UMT分别融合其它蛋白后可溶性表达水平的变化。UMT可以有效指示MBP和TEVp及其突变体的水溶性，但对重组玉米蛋白水溶性的结果不佳，这和部分蛋白用GFP指示效果一致, N端SUMO标签对改善蛋白水溶性效果有限。
　　6.分析了玉米UMT作为双功能报告蛋白筛选可溶性靶蛋白的效应。表达UMT融合蛋白的大肠杆菌，菌落数量与一定浓度的亚碲酸钾成反比，但在紫外光下观察到红色荧光的单菌落，质粒经酶切验证与预期分子量大小一致，SDS-PAGE和蛋白印迹验证了预期可溶性融合蛋白的表达。
　　7.分析了UMT上下游代谢相关酶对玉米UMT作为报告蛋白的影响。5-氨基酮戊酸合酶和尿卟啉原脱羧酶与UMT融合表达后，产生新的荧光物质，其它3个酶对细胞荧光颜色没有显著影响。
　　综上所述，不同植物UMT都可以作为报告蛋白检测特定标签或靶蛋白在大肠杆菌的功能或可溶性表达，对其应用的局限性也做了相应的研究，本研究发展的报告系统可用于高效筛选可溶性蛋白。

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1 文献综述

1.1 荧光蛋白的种类

1.2 血红素和西罗血红素的生物合成途径

1.3 尿卟啉原III甲基化酶的研究进展

2 引 言

2.1 研究目的与意义

2.2 研究内容

3 材料与方法

3.1 材料

3.2 仪器与设备

3.3 实验方法

4 结果与分析

4.1 大麦bUMT与mbUMT的氨基酸序列比对

4.2 表达野生型大麦UMT及其突变体的重组菌斑荧光观察

4.3 表达野生型大麦UMT及其突变体重组细胞破碎上清液光谱扫描

4.4 表达野生型大麦UMT及其突变体重组细胞荧光强度测定

4.5 野生型大麦UMT及其突变体的表达水平

4.6 表达野生型大麦UMT及其突变体重组细胞在不同条件下的荧光强度

4.7 野生型大麦UMT及其突变体指示蛋白质的生理功能

4.8 玉米UMT指示MBP和TEVp及其突变体的水溶性

4.9 玉米UMT在不同条件指示MBP和TEVp及其突变体的水溶性

4.10 玉米UMT指示其它玉米蛋白的水溶性

4.11 玉米UMT作为双功能报告蛋白的应用

4.12 UMT上下游代谢相关酶对UMT作为报告蛋白的影响

5 讨 论

5.1 大麦UMT及其突变体的性质分析

5.2 玉米UMT指示蛋白质的水溶性

5.3 玉米UMT作为双功能报告蛋白的应用

5.4 UMT上下游代谢相关酶对UMT作为报告蛋白的影响

6 结 论

参考文献

附录 1

附录 2

致谢

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