缺铁黄化对‘砀山酥梨’叶片光合特性、氮代谢相关酶活性及基因表达的影响

摘要

铁是梨树生长发育所必需的16种营养元素之一，在梨树蛋白质和核酸的合成、光合作用、呼吸作用等诸多生理代谢过程中发挥着极其重要的作用。在中性和碱性条件下，铁有效性低，容易发生Fe(OH)3沉淀。在高pH值条件下，每增加1个pH单位，溶液中活性铁就减少1000倍，黄河故道地区是我国梨主产区之一，土壤pH值在7.5~8.0之间，缺铁现象严重。
　　前期研究表明，铁缺乏时，还影响其他矿质元素的吸收，‘砀山酥梨’黄化叶片中不仅铁含量明显下降，其氮含量也明显下降，且存在明显的相关性。铁又是氮代谢过程中很多酶的活化剂，如硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）等，因此，研究铁胁迫条件下，矿质元素之间的互作有一定的理论价值。
　　氮代谢是果树的基本生理过程之一。氮素同化的主要途径是经过硝酸盐还原为铵后直接参与氨基酸的合成与转化，期间硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸合酶（GOGAT）与谷氨酰胺合成酶（GS）等关键酶参与了催化和调节。以氨基酸为主要底物在细胞中合成蛋白质，再经过对蛋白质的修饰、分类、转运及储存等，成为果树有机体的组成部分。
　　目前有关果树缺铁对其相关基因与蛋白活性的影响研究较多，有关缺铁对氮元素含量、氮代谢及其相关基因与蛋白活性的影响国内外还未见报道。为了探讨缺铁对‘砀山酥梨’叶片光合速率、叶绿素荧光特性、N代谢相关酶活性及相关基因表达的影响，试验以不同黄化程度的叶片为试材，测定黄化叶片中Fe、N的含量、叶片光合速率、叶绿素荧光特性及Fe、N代谢相关酶的活性，分析了缺铁对N元素含量的影响及其之间的相关性；同时克隆了叶片中三价铁螯合物还原酶基因（FRO）、硝酸还原酶基因（NR）、亚硝酸还原酶基因（NiR）、谷氨酸合酶基因（GOGAT）与谷氨酰胺合成酶基因（GS），并通过Real-time PCR技术分析其在不同黄化程度叶片中的相对表达量。主要结果如下：
　　1、不同程度黄化叶片中Fe含量的变化与N的含量呈极显著正相关，其相关系数为r（Fe，N）=0.934。说明缺铁的同时，也引起了N元素的缺乏。
　　2、‘砀山酥梨’黄化叶片净光合速率降低，胞间CO2浓度升高，光合速率下降为非气孔限制；黄化对叶片光系统的影响，首先表现为放氧复合体（OEC）结构的破坏，进而导致叶片的PSII反应中心受到不同程度的伤害，造成电子传递链受阻，降低叶片的光能利用效率。
　　3、‘砀山酥梨’黄化叶片中FCR活性均显著低于对照。随黄化程度的增加， FCR活性呈逐渐上升的趋势，且达到极显著差异。黄化叶片中NR、NiR活性均显著低于对照，随黄化程度的增加，黄化叶片中NR、NiR活性均呈逐渐上升的趋势，且达到极显著差异。轻度黄化叶片的GOGAT活性显著高于对照，而随黄化程度的增加，GOGAT活性呈下降的趋势，中度黄化、重度黄化叶片谷氨酸合酶与对照相比差异不显著；轻度黄化、中度黄化叶片的GS活性与对照相比差异不显著，重度黄化叶片的GS活性显著低于对照。
　　4、通过查找GenBank并比对梨基因组数据库得到FCR、NR、NiR、GAGAT和GS的同原序列，设计引物进行扩增，验证并获得了FCR、NR、NiR、GAGAT和GS序列。生物信息学分析表明，FCR基因序列编码区（CDS）为2166 bp，编码721个氨基酸，编码的蛋白质可能位于质膜，属于疏水蛋白，二级结构含有45.91％的α-螺旋；NR基因序列编码区（CDS）为2709 bp，编码902个氨基酸，编码的蛋白质可能位于细胞质，属于疏水蛋白二，级结构含有29.05%的α-螺旋；NiR基因序列编码区（CDS）为1758 bp，编码585个氨基酸，编码的蛋白质可能位于细胞核，属于疏水蛋白，二级结构含有37.44%的α-螺旋；GOGAT基因序列编码区（CDS）为4887 bp，编码1628个氨基酸，编码的蛋白质可能位于细胞质，属于亲水蛋白，二级结构含有39.31%的α-螺旋；GS基因序列编码区（CDS）为1071 bp，编码356个氨基酸，编码的蛋白质可能位于微体，属于亲水蛋白，二级结构含有28.37%的α-螺旋。
　　5、FCR、NR、NiR、GOGAT和GS活性与其基因的表达量的变化趋势具有一致性，说明基因的表达有利于酶活性的增加，黄化引起的缺铁影响了氮的代谢。

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1 文献综述

1.1 铁素营养的研究进展

1.2 氮素营养的研究进展

1.3 光合作用的研究进展

2 引 言

2.1 研究的目的和意义

2.2 研究的内容

2.3 技术路线

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 主要试剂

3.3 试验方法

4 结果与分析

4.1 叶片中Fe、N含量分析

4.2 叶片中叶绿素含量的比较

4.3 叶片光合特性的测定

4.4 叶片中叶绿素荧光的比较

4.5 黄化叶片中相关酶活性的比较

4.6 相关基因的克隆

4.7 ‘砀山酥梨’相关基因生物信息学分析

4.8 叶片中相关基因的表达分析

5 讨 论

5.1 黄化对叶片发育及光合速率的影响

5.2 黄化对叶片叶绿素荧光特性的影响

5.3 黄化影响叶片中Fe、N含量及相关酶活性和相关酶基因的表达

6 结 论

参考文献

致谢

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