稻纵卷叶螟几丁质脱乙酰酶基因家族的特征与鉴定

摘要

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)属于鳞翅目，螟蛾科，是水稻产区的主要害虫之一，广泛分布于热带和温带各稻区。目前对该虫害的防治主要是化学防治，但不利于环境保护和食品安全。如何利用生物防治有效控制该虫害是当前研究的重要课题。
　　几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1，4糖苷键链接而成的多糖，是昆虫表皮、消化道的围食膜和体内组织基底膜的主要组成成分，对昆虫表皮和围食膜的结构形态和大小维持具有重要的作用。几丁质脱乙酰酶（Chitin deacetylase，简称CDA），是昆虫几丁质降解酶系的一员，能催化几丁质脱乙酰为壳聚糖。关于稻纵卷叶螟CDA目前尚未有研究报道。昆虫的生长发育伴随着几丁质的合成和降解，而人类和哺乳动物均没有几丁质代谢系统。因此，通过破坏昆虫几丁质代谢平衡来开发生物杀虫剂，具有潜在的应用价值。
　　本研究依据稻纵卷叶螟4龄转录组数据库分析表明稻纵卷叶螟至少存在5条CDAs，通过RACE技术结合转录组数据分别获得了含有完整ORF序列的CmCDA1，CmCDA2，CmCDA4以及只有部分序列的CmCDA5和CmCDA6(NCBI登录号分别为1767645，1764496，1754502，1768147和1787955)。CmCDA1，全长2020个碱基，包括一个1620个碱基的ORF框，编码一个含有539个氨基酸的蛋白质，其分子量约为61.4kDa，等电点pI为5.07; CmCDA2，全长2158个碱基，包括一个1632个碱基的ORF框，编码一个含有543个氨基酸的蛋白质，其分子量约为61.7kDa，等电点pI为5.35; CmCDA4，全长1537个碱基，包括一个1485个碱基的ORF框，编码一个含有494个氨基酸的蛋白质，其分子量约为55.9kDa，等电点pI为5.51。
　　昆虫CDA根据含有保守功能域的数目可以分为五大类GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。本研究通过结构及系统进化分析表明，CmCDA1和CmCDA2含有几丁质结合区(ChBD)、低密度脂蛋白受体区(LDLa)和几丁质催化区，属于GroupⅠ;CmCDA4只含有ChBD和几丁质催化区，属于GroupⅢ。只有部分序列的CmCDA5通过NCBI序列比对，与其他昆虫的CDA5同源性比较高，属于GroupⅣ;而CmCDA6和其他昆虫属于GroupⅤ的CDA同源性最高。
　　组织和发育特异性表达分析表明:CmCDA1、CmCDA2、CmCDA4在头部的表达量显著高于其他组织;CmCDA1在四龄中肠的表达量与在脂肪体的表达量相比达到差异极显著;CmCDA2在中肠和表皮的表达量与在脂肪体的表达量相比也达到差异极显著。CmCDA1、CmCDA2和CmCDA4在成虫期的表达量都比幼虫期高。
　　本研究获得了稻纵卷叶螟3个完整ORF序列的CDA基因和2个CDA的部分序列，并分析其分子特性和表达情况，为有害昆虫的生物防治和生物杀虫剂的研制提供了理论依据。

目录

声明

摘要

文献综述

1．稻纵卷叶螟的危害及特征

1．1 稻纵卷叶螟的危害

1．2 稻纵卷叶螟的特征

1．3 目前防治措施

1．4 稻纵卷叶螟防治存在的问题

2．几丁质在害虫防治方面的应用

2．1 几丁质简介

2．2 昆虫几丁质的结构及其应用

3．昆虫几丁质脱乙酰酶

3．1 几丁质脱乙酰酶简介

3．2 昆虫几丁质脱乙酰酶的分类

3．3 几丁质脱乙酰酶的研究进展

3．4 几丁质脱乙酰酶在昆虫防治中的作用

1 引言

1．1 研究目的和意义

1．2 研究内容

1．3 技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 昆虫来源

2．1．2 质粒和菌株

2．1．3 主要试剂

2．1．4 常用试剂的配置

2．1．5 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 利用RACE技术克隆CmCDA1

2．2．2 转录组数据库分析获取其它CmCDAs

2．2．3 CmCDAs的生物信息学分析

2．2．4 CmCDAs发育和组织特异性表达分析

3 结果与分析

3．1 RACE技术克隆得到CmCDA1

3．1．1 总RNA的提取

3．1．2 CmCDA1基因特异性片段及其序列分析

3．1．3 CmCDA1基因的3’-RACE结果

3．1．4 CmCDA1基因的5’-RACE结果

3．1．5 CmCDA1的cDNA序列及其氨基酸序列

3．2 转录组数据库分析获得其它CmCDAs

3．2．1 CmCDA2的cDNA序列及其氨基酸序列

3．2．2 CmCDA4的cDNA序列及其氨基酸序列

3．2．3 CmCDA5和CmCDA6部分氨基酸序列分析

3．3 CmCDAs的生物信息学分析

3．3．1 信号肽分析

3．3．2 蛋白质疏水性分析

3．3．3 蛋白质跨膜结构分析

3．3．4 CmCDAs的催化区序列比对

3．3．5 CmCDAs蛋白聚类分析

3．4 发育和组织特异性表达分析

3．4．1 CmCDAs在4龄幼虫不同组织的表达特性

3．4．2 CmCDAs在不同时期的表达特性

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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