弓形虫GRA4、GRA7、GRA20、ROP20的序列分析及GRA4、GRA7重组乳酸菌的免疫效果

摘要

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是能够感染所有温血动物的机会性致病寄生虫，它寄生于机体的有核细胞内从而引发弓形虫病（Toxoplasmosis）。该寄生虫主要通过污染的食物和水感染宿主，同时也存在垂直传播，通过母婴传播的方式来感染子代，孕妇若感染弓形虫可能导致胎儿流产、畸形或者死胎等。据统计全球约三分之一的人口感染过弓形虫，并且其对畜牧业的影响也非常重大，因此在医学和兽医学上均受到广泛重视，但是目前并没有有效的药物能够根除弓形虫，因此弓形虫疫苗的研制一直是近年来研究热点之一。
　　自然界中广泛存在的乳酸菌是构成益生菌的重要成员之一，它不仅可以抑制人和动物肠道有害菌的生长，还能调节菌群的平衡和内环境pH的稳定，使机体保持稳定的免疫状态。乳酸菌是一类具有佐剂活性的非病原菌，不产生内毒素，通过它表达的外源蛋白可直接随菌体服下，是目前较为理想的转化和表达系统，且具有广阔的应用前景。
　　本论文对弓形虫致密颗粒蛋白4、7、20（GRA4、GRA7、GRA20）和棒状体蛋白20（ROP20）基因序列的变异做了分析。首先对不同宿主和地理来源的虫株进行PCR扩增，再进行克隆测序，然后用Clustal X1.83进行序列比对，最后再用最大相似法（maximum likelihood，ML）、邻接法（neighbor joining，NJ）和最大简约法（maximum parsimony，MP）构建种系发育树。结果表明：在12株不同虫株当中，GRA4和GRA7的基因序列分别为966bp和712bp，其种内变异率分别为0~2.4％和0~2.7%；在16株虫株中，GRA20基因序列为1586bp，种内变异率为0~7.9%，当去掉Ⅲ型虫株（CTG、VEG）后，种内变异率为0~0.7%；在18株不同的弓形虫虫株当中，ROP20基因序列为1659bp，种内变异率为0~1.4%。通过构建种系发育树显示，GRA4基因不能较好的反应不同虫株间的遗传变异关系，GRA7基因能区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型虫株，GRA20基因能区分Ⅰ型和Ⅲ型虫株，ROP20基因能区分弓形虫Ⅰ型和ToxoDB＃9型虫株。
　　本论文还以乳酸杆菌作为载体来探讨弓形虫GRA4和GRA7在口服免疫方式下的免疫效果。首先根据ToxoDB网站上收录GT1型虫株的GRA4和GRA7基因序列用Primers5.0设计带有酶切位点NcoⅠ和XbaⅠ的引物，并在两个蛋白的C端引入His标签。经过PCR扩增和克隆测序，得到的GRA4和GRA7序列，并将其分别连接转化至大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409中，由此成功构建重组表达载体pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7。将重组质粒pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7通过电转化技术转入Lb.plantarum NC8中，并进行双酶切及PCR鉴定，再用Western-blot分析，成功制备弓形虫GRA4和GRA7重组乳酸菌后，再将其免疫小鼠。首先将小鼠分为空白组、空白奶粉组和Nc8-pSIP-409乳酸杆菌空载体组三个对照组以及Nc8-409-GRA4和Nc8-409-GRA7重组乳酸杆菌组两个实验组，以口服的方式来免疫小鼠。免疫程序为每周连续口服三天，每次每只小鼠灌服1.0×109cfu/200μL，连免两周后间隔一周，再加强免疫两次。待免疫结束后，测定相应的体液免疫和细胞免疫指标，并在一免后42d，用强毒株RH速殖子（103个/只）通过腹腔接种感染小鼠，记录每组小鼠存活时间。实验结果显示：弓形虫GRA7重组乳酸菌疫苗在对小鼠口服免疫后其机体内可产生较高水平的IgG和IgG2a以及IFN-γ，并产生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8-T细胞，能够有效地产生Th1型免疫应答，而GRA4重组乳酸菌疫苗的免疫原性较弱。在对小鼠腹腔注射弓形虫RH速殖子后，对照组小鼠的平均存活时间为6.1d，NC8-409-GRA7组小鼠的平均存活时间延长至6.8d，但与对照组相比无显著差异，而NC8-409-GRA4组小鼠的平均存活时间与对照组相比未延长。
　　本实验首次将弓形虫GRA4、GRA7与乳酸菌重组进行口服免疫，实验证明弓形虫GRA7重组乳酸菌疫苗具有一定的免疫原性，能对弓形虫感染产生一定的免疫保护作用，为今后研制抗弓形虫新型疫苗提供了新的思路。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

主要英文缩写

文献综述

1. 弓形虫及弓形虫病概述

2、抗弓形虫疫苗研究进展的概述

3. 弓形虫GRA4、GRA7、GRA20及ROP20概述

4. 乳酸菌概述

5. 结语

引言

1 材料与方法

1.1材料

1.2主要仪器

1.3弓形虫GRA4、GRA7、GRA20、ROP20基因克隆及序列分析

1.4弓形虫GRA4、GRA7重组乳酸菌的制备

1.5弓形虫GRA4、GRA7重组乳酸菌疫苗的免疫效果评价

2结果与分析

2.1弓形虫GRA4基因克隆及序列分析

2.2弓形虫GRA7基因克隆及序列分析

2.3弓形虫GRA20基因克隆及序列分析

2.4弓形虫ROP20基因克隆及序列分析

2.5弓形虫GRA4、GRA7重组乳酸菌的制备

2.6弓形虫GRA4、GRA7重组乳酸菌疫苗免疫效果的评价

3讨论

3.1弓形虫GRA4、GRA7、GRA20、ROP20基因克隆及序列分析

3.2弓形虫GRA4、GRA7重组乳酸菌免疫效果的评价

结论

参考文献

致谢

个人简介