外源激素对家蚕磷酸吡哆醛合成酶转录水平的影响及转录组学分析

摘要

维生素B6(VB6)是维持人体正常生理代谢所必需的营养素，主要辅酶形式为磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)，PLP催化着涉及氨基酸的多种代谢反应，其动态平衡及合成是 VB6营养的核心问题，与人类多种神经疾病相关。磷酸吡哆醛激酶（Pyridoxal kinase，PLK）和磷酸吡哆醇氧化酶（Pyridoxine phosphate oxidase，PNPO）是PLP的合成酶，维持着哺乳动物细胞和组织内PLP的动态平衡。酶的调节一般从结构水平和合成水平两个方面进行研究，结构水平已经研究的比较透彻，而合成水平如转录翻译等方面还需深入，合成水平的调节有多种方式，激素是主要的途径，但激素对PLP和VB6方面的调节还未见报道。家蚕由于5龄末期大量合成丝蛋白，氨基酸代谢旺盛，PLP需要量增加，因此其合成酶可能受到激素的调控。
　　家蚕生长过程中主要受到保幼激素（Juvenile hormone，JH）与蜕皮激素（20-hydroxyecdysone，20-E）的调控。本研究采用实时荧光定量PCR（Realtime quantitative PCR，RT-qPCR）测定了经不同剂量的20-E和保幼激素类似物（Juvenile hormone analogue，JHA）处理后家蚕PLK、PNPO的表达，并观察激素对家蚕生长发育经过的影响，还对5龄后期家蚕经20-E处理的脂肪体进行了转录组学分析，探讨20-E对家蚕代谢通路的影响。主要结果如下：
　　1.在5龄前期用低剂量的20-E处理家蚕延迟其生长发育经过，而高剂量的20-E处理5龄前期家蚕导致其生长不正常最后死亡。在中后期用20-E处理家蚕缩短发育经过；5龄前中期家蚕经过JHA处理后，发育经过有不同程度的延长，5龄后期家蚕经JHA处理后无显著变化。
　　2.在20-E能提高5龄前期家蚕丝腺中PLK和PNPO的转录水平，对5龄后期它们的转录水平无影响；5龄后期家蚕幼虫经JHA处理后降低了丝腺中PLK和PNPO的转录水平，而JHA处理5龄前期家蚕后，丝腺中它们的转录水平无显著变化。
　　20-E提高了5龄前期家蚕脂肪体中PNPO的转录水平，但对5龄后期PNPO的转录水平有阻碍作用。JHA在5龄前、中期处理家蚕48 h后，脂肪体PLK的转录水平明显降低，但对5龄后期幼虫，JHA使脂肪体中PLK的转录水平下降，却提升了PNPO的转录水平。
　　3.对20-E处理的5龄5天家蚕脂肪体进行转录组测序，并与未被处理的家蚕进行比对，得到606个差异基因。对这些差异基因进行GO分析，发现显著性富集的GO term大都集中在生物学过程方面，尤其是各种代谢过程；Pathway分析表明富集的代谢通路大都与新陈代谢、免疫系统相关。
　　本研究明确了20-E和JHA对家蚕PLK和PNPO的调节作用，为进一步分析PLP的动态平衡及VB6的代谢工作奠定基础，为人类VB6的营养问题提供参考。

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1文献综述

1.1维生素B6及磷酸吡哆醛在生物体内的合成途径

1.2 PLK的研究进展

1.3 PNPO的研究进展

1.4 保幼激素、蜕皮激素的研究进展

1.5实时荧光定量(PCR real-time quantitative PCR)技术

1.6转录组技术

2 引言

2.1 研究背景及意义

2.2 研究内容

3材料与方法

3.1实验材料、设备及主要试剂

3.2实验方法

3.3转录组分析

4结果与分析

4.1 RNA的提取及cDNA合成

4.2激素处理对5龄家蚕发育经过的影响

4.3 激素处理后家蚕PLK、PNPO的转录水平

4.4 20-E处理家蚕后转录组学分析

5讨论

6结论

参考文献

致谢

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