外源植物激素诱导的怀牛膝转录组学研究

摘要

怀牛膝是河南著名的“四大怀药”之一，也是我国重要的大宗药材。本文以2mg/LNAA+1mg/L6-BA喷施处理的怀牛膝根和叶为实验材料，利用实时荧光定量PCR技术和转录组测序，对怀牛膝主要药用成分三萜皂苷合成途径中关键酶基因及其时空表达特异性和外源植物激素处理促进根中三萜皂苷积累的分子机制进行了研究，旨在为深入研究怀牛膝主要药用成分三萜皂苷合成中关键酶基因的克隆与功能验证和外源植物激素对牛膝生长发育及三萜皂苷代谢途径的调控提供理论依据。其主要研究结果如下:
　　1.首次获得了怀牛膝不同组织中响应激素相关基因的转录组测序基本信息。共获得312,151,164个raw reads，其中Ab-L-CK1、Ab-L-CK2、Ab-R-CK1、Ab-R-CK2、Ab-L-T1、Ab-L-T2、Ab-R-T1和Ab-R-T2分别有35，359，331、27，630，495、32，028，032、33，307，916、34，923，635、33，637，422、48，223，422和67，040，748个raw reads。将低质量的reads过滤后，共获得了26.5G的数据量。组装后共获得100，987个Unigenes，其平均序列长度为1146.8bp，最大长度为15，803bp，最小为224bp。Unigenes序列长度在200和1000bp之间的有60，356个;1000和2000bp之间的有23，230个，大于2000bp有17，401个，短序列的Unigenes个数多于长序列，这符合转录组序列长度分布的一般规律。
　　2.获得了Unigene在多个数据库中的功能注释信息。其中Swiss-Prot、GO、COG和KEGG数据库分别注释上了31，634条、20，488条、21，715条和12，762条urfigene，分别占31.33％、20.29％、21.50％和12.64％。
　　3.得到了Unigene的GO、COG及KEGG功能分类信息。被归类到GO功能分类3个分子功能、细胞组分和生物过程大类的20，488个unigenes涉及到并42个更为具体的亚类。代谢过程亚类中涉及的Unigenes最多为14，053(68.59％)。21，715个Unigene被注释到25种COG分类中，其中信号转导机制中涉及的Unigenes的数目最多为12，007(55.29％)。12，762个Unigene被注释涉及了303个代谢途径，有377个Unigene参与萜类和聚酮化合物的代谢过程。
　　4.基本明确了差异表达基因的相关信息。L-CK与L-T、R-CK与R-T、L-CK和R-CK以及L-T和R-T之间分别获得20，896、9，812、28，339和2，731个差异基因。L-CK与L-T及R-CK与R-T两组差异基因GO显著富集的功能类别分别为47和35条，其中生物过程亚类别的功能条目相差6条。KEGG显著富集到了萜类合成、光合作用相关的代谢通路。在处理组的叶中，三萜皂苷合成相关酶基因显著上调，在处理根中基本没有变化。此外，在外源植物激素喷施后，植物体内激素合成及信号转导相关基因和转录因子也参与调控次级代谢三萜皂苷的合成。
　　5.利用KEGG代谢通路，挖掘了395个参与三萜皂苷生物合成的候选基因，包含22个MVA途径关键酶基因、23个MEP途径关键酶基因、19个三萜皂苷碳骨架形成过程关键酶基因、5个氧化鲨烯环化酶基因、186个CYP450基因、122个UDP-糖基转移酶基因和18个糖基转移酶基因。利用生物信息学技术，推测UN082587具有催化β-香树脂合成齐墩果酸的生物学功能。
　　6.利用荧光定量PCR技术，探究10个三萜皂苷合成关键酶基因的时空表达模式。结果表明除了GGPPS和CAS基因在叶中表达量较高之外，HMGS、HMGR、SS、SE、β-AS和CYP450基因在根和果实中高表达。
　　以上响应外源植物激素的怀牛膝转录本，丰富了怀牛膝基因表达谱，挖掘了大量的候选差异表达基因和三萜皂苷合成相关候选基因，为外源植物激素调控三萜皂苷积累的分子机制及定向选育三萜皂苷含量高的怀牛膝新品种奠定了基础。

目录

摘要

缩略词表(Abbreviation)

第一章 前言

1．1 怀牛膝概况

1．1．1 怀牛膝生物学特征研究

1．1．2 怀牛膝主要化学成分及其药理作用

1．2 齐墩果烷型三萜皂苷代谢途径研究

1．2．1 三萜皂苷的生物合成途径研究

1．2．2 三萜皂苷生物合成关键酶基因的研究进展

1．3 植物生长调节剂在药用植物中的应用

1．4 RNA-Seq及其在药用植物研究中的应用

1．4．2 RNA-Seq在药用植物次级代谢产物生物合成中的应用

1．4．3 转录组测序在牛膝研究中的应用

1．5 本课题的主要研究内容与技术路线

1．5．1 主要研究内容

1．5．2 技术路线

1．5．3 创新点

1．6 本课题的目的与意义

第二章 外源植物激素诱导的怀牛膝转录组分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器与试剂

2．1．3 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 怀牛膝测序样品总RNA的提取与质检

2．2．2 怀牛膝转录组测序数据质量评估与产量统计分析

2．2．3 怀牛膝转录组测序组装

2．2．4 Unigene的功能注释

2．2．5 基因的表达水平分析

2．2．6 外源植物激素处理怀牛膝的差异基因分析

2．2．7 三萜皂苷合成相关基因的挖掘

2．2．8 三萜皂苷合成候选关键酶差异基因的表达分析

2．2．9 植物激素合成及信号转导途径中差异基因的挖掘

2．2．10 差异表达转录因子的挖掘

2．2．11 qRT-PCR验证转录组测序结果

2．3 讨论

2．3．1 Unigenes的功能注释率

2．3．2 转录组测序已成为挖掘药用植物功能基因的有效手段

2．3．3 荣莉酸介导三萜皂苷合成的转录调控

第三章 怀牛膝三萜皂苷合成关键酶基因的时空表达分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 主要仪器与试剂

3．1．3 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 三萜皂苷生物合成关键酶基因的空间特异性表达

3．2．2 三萜皂苷生物合成关键酶基因的时间特异性表达

3．3 讨论

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

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