初情期大鼠下丘脑差异lncRNAs及mRNAs的筛选

摘要

初情期提前在家畜生产中是一种重要的经济性状，该性状受到诸多因素调控，表观遗传就是其中之一。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为一种表观修饰方式，其调控初情期的研究未见报道。因此，本试验的目的是利用RNA-seq技术筛选初情期前及初情期大鼠下丘脑差异表达的lncRNAs和mRNAs并预测其功能。本试验分为如下几个部分：
　　（1）分别取4只初情期前（出生后25d）及初情期（以阴门开启为标志）SD大鼠下丘脑，混合同一时期样品并提取总RNA，构建RNA文库，通过文库质量检测保证文库合格后，进行RNA-seq测序得到原始数据。结果显示：初情期前及初情期大鼠下丘脑的RNA文库经质量控制后分别得到110868128和98901278条 reads；初情期前与初情期分别有99129182（89.41％）和89032171（90.02%）条reads匹配到大鼠基因组。对reads已知类型分析可知两时期reads中具有73.51%的reads为编码蛋白基因，25%的reads为其他功能基因。
　　（2）通过数据评估，从中筛选出差异表达的lncRNA和mRNA继而进行靶基因预测、GO富集分析以及KEGG富集分析。另外，对mRNA与lncRNA的整体表达、结构及保守性进行对比。结果显示：mRNA总体表达量高于lncRNA；lncRNA的保守性显著高于蛋白编码基因（P<0.00001）；大多数lncRNA的开放阅读框长度小于mRNA，主要集中在0~200的区间内；lncRNA与mRNA的转录本长度分布不同；多数lncRNA包含2~4个外显子，与mRNA相比明显不同。共获得转录自1283个基因的1444条差异表达转录本；相对于初情期前大鼠，初情期上调转录本868条，下调转录本576条；其中包含差异表达lncRNA转录本共有364条（已知lncRNA转录本为146条，新发现lncRNA转录本为128条）；差异mRNA转录本共有1080条。通过cis方式预测差异表达lncRNA的靶基因，在lncRNA基因上下游10K和100K范围内分别预测到1633个和8425个靶基因。差异表达lncRNA靶基因并未出现显著富集的GO模块；KEGG通路富集分析中仅有核糖体通路显著富集（P＜0.05）；通过聚类分析对比两时期KEGG通路富集差异，结果显示核糖体通路和加压素调节水的重吸收通路在两期存在不同。差异mRNA出现许多显著富集的GO模块，GO聚类分析表明神经系统发育及突触这两块在初情期前及初情期时存在差异；KEGG通路富集显示谷氨酸突触、核糖体等6个通路存在差异（P＜0.05），KEGG聚类分析显示胰岛素分泌及催产素信号这两条通路在两时期间存在不同。
　　（3）利用荧光定量PCR检测随机选取的差异表达的lncRNA。结果显示：8条差异表达的lncRNA所展现的趋势与测序结果一致，但具体差异倍数与测序结果不同。
　　总之，本试验首次报道了大量特异以及差异性表达于初情期大鼠下丘脑的lncRNAs/mRNAs。这些lncRNAs/mRNA在神经系统发育、突触、核糖体通路、加压素调节水的重吸收通路、胰岛素分泌及催产素信号通路上的富集程度存在差异性，提示下丘脑中lncRNAs/mRNAs可能通过参与这些细胞信号通路或生物学过程来调控大鼠初情期启动。

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文献综述

1 长链非编码RNA的发现

2 长链非编码RNA的分类

3 长链非编码RNA的功能

4 长链非编码RNA在生殖领域的研究进展

5 展望

引言

1 材料与方法

1.1试验材料

1.2 试验方法

1.3数据分析方法

2结果

2.1大鼠外阴及卵巢组织学观察

2.2下丘脑组织总RNA质量

2.3 测序数据质量评估

2.4 测序数据产出

2.5 参考基因组比对分析

2.6 RNA-seq整体质量评估

2.7 候选长链非编码RNA筛选

2.8 LncRNAs与mRNAs表达水平、保守性及结构比较

2.9 差异lncRNAs及mRNAs筛选

2.10 LncRNA靶基因预测

2.11 差异lncRNAs靶基因及mRNAs转录本GO分析

2.12 差异lncRNAs靶基因及mRNAs转录本KEGG分析

2.13 差异表达lncRNA的荧光定量PCR验证

3讨论

3.1 试验动物选择

3.2 LncRNA测序方法的选择

3.3 RNA-seq测序质量

3.4 RNA-seq整体评估

3.5 LncRNA筛选

3.6 LncRNA靶基因预测

3.7 差异lncRNA靶基因及mRNA GO及KEGG富集分析

4结论

参考文献

附录

致谢

个人简历