发酵液pH对乳酸乳球菌有氧呼吸的影响

摘要

乳酸乳球菌广泛应用于发酵乳制品的生产，在外源基因表达及活菌疫苗制品等方面也具有重要的应用价值。而发酵剂的细胞密度是决定发酵剂性能、提高发酵产量和降低生产成本的关键因素，因此乳酸乳球菌的高密度培养则显得尤为重要。乳酸乳球菌属于兼性厌氧菌，胞内缺乏完整的呼吸链，其产能方式为发酵。研究表明，当外源血红素存在时，乳酸乳球菌可以产生有氧呼吸所需的关键酶，形成完整的电子传递链，其产能方式由发酵转变为有氧呼吸，其生物量和生存力都得到显著提升。
　　pH值对包括营养物质的吸收和胞内酶活性等诸多细胞生理方面具有十分重要的影响。在实际工业大规模生产中pH值是一个比较常用的发酵控制参数，因此，研究乳酸乳球菌在什么样的发酵液pH值培养条件下其有氧呼吸效率最高，这对于工业上利用有氧呼吸来获得乳酸乳球菌高细胞密度培养物具有较强的实践意义。基于以上分析，本实验通过测定不同发酵条件（发酵液pH值、通气、添加血红素）下乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)菌株生物量、发酵液残糖量，对比研究了发酵液pH值对菌体得率和有氧呼吸效率的影响，优化建立了一种酸化丙酮法测定胞内血红素浓度的分光光度计法，并研究了发酵液pH值与胞内血红素积累之间的关系。主要研究结果如下：
　　1.在仅通气（A条件）下，乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)最大生物量比通气且添加4μg/mL血红素（HA条件）下的小很多，只有后者的40％，并且其生长速率在对数前期就低于后者，对数期比后者长3 h，这表明添加外源血红素能使乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)进行全程的有氧呼吸，而不是先发酵后呼吸。在这两个培养条件下，发酵液pH值均随着培养时间延长而下降，发酵终点pH值基本一致，但A条件下发酵液pH下降速度明显高于HA条件下的，表明有氧呼吸条件下酸胁迫依然存在，但胁迫程度低于发酵条件下的。将乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)菌株培养在通气、添加血红素且pH恒定为6.5条件下（HPA6.5）时，最高生物量比HA条件下的高很多；不通气添加4μg/mL血红素并控制pH值为6.5(HP6.5)条件下乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)的最高生物量比HPA6.5条件下的明显降低，并且最高生物量下的菌体得率只有HPA6.5的67%，这表明在消除酸胁迫条件下乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)在有氧呼吸生长过程中将还原糖转化成生物量的能力明显高于发酵条件下的。
　　2.将发酵液控制在不同pH值下（5、5.5和6）分别进行有氧呼吸和发酵培养。结果表明，HPA5.0、HPA5.5、HPA6.0和HPA6.5条件下的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)最高菌体得率分别比相应不通气条件下的（即HP5.0、HP5.5、HP6.0、HP6.5条件）增加了244%、180%、94%、和50％，因此，在pH5～6.5范围内，pH值对细胞有氧呼吸效率影响存在如下趋势：pH5>5.5>6>6.5。
　　3.当乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)发酵液浊度(OD600)>2时，在血红素浓度为0.1-4μg/mL范围内，采用波长为380 nm的酸性丙酮分光光度计法可准确地测定胞内血红素浓度。
　　4.在HPA条件基础上控制乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)发酵液pH值分别为6.5、6.0、5.5和5.0，测定胞内血红素浓度变化曲线。结果表明，发酵液pH值对细胞吸收血红素能力的影响存在如下趋势：pH5.5>pH6>pH5>pH6.5。对比分析不同培养条件下胞内血红素浓度与生物量、有氧呼吸效率之间的关系，发现HPA5.5条件下时生物量最高与pH5.5的环境更能促进乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)胞内积累血红素，从而促进其进行有氧呼吸。

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1 文献综述

1.1乳酸菌及功能应用

1.2.氧对乳酸菌生长的影响

1.3乳酸菌的有氧呼吸

1.4有氧呼吸对乳酸菌生理的影响

1.5乳酸菌有氧呼吸的应用前景及存在的问题

1.6 血红素的测定方法

1.7蛋白浓度的测定方法

1.8 还原糖的测定方法

2 引言

3 材料与方法

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 菌种冻存管保存法

3.4乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)菌株生物量测定

3.5.发酵液中还原性糖含量的测定

3.6 胞内蛋白的测定

3.7血红素浓度的测定

3.8.无细胞提取物的制备

3.9．静息细胞处理

3.10．数据分析

4实验结果与分析

4.1不同发酵条件下乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)生长特性

4.2.胞内血红素含量的测定

4.3发酵pH值对乳酸乳球菌NZ9000（pNZ8148）吸收血红素能力的影响

5讨论

6结论

参考文献

致谢

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