DNA条形码检测技术在媒介鼠类鉴定中的研究与示范应用

摘要

目的：
　　以国境口岸截获鼠类和地区捕获鼠类为对象，探索DNA条形码检测技术的准确性和一般模式;探究DNA条形码技术用于近缘种的鉴别;探索DNA条形码技术用于国境口岸远洋油轮截获的腐烂鼠类的鉴别;探索DNA条形码技术追溯截获媒介的地理来源的可行性。
　　方法：
　　本研究通过对在贵州茂兰、中俄边境的黑瞎子岛和山东黄岛出入境口岸三个地区采集或截获的2科5属12种共320个鼠类个体，提取基因组DNA，扩增COI基因序列，并进行测序，部分序列上传NCBI和BOLD数据库，对所得序列进行多重序列比对，基于Kimura双参数模型计算种内种间遗传距离，用NJ和MP法构建系统发育树，并进行序列聚类和系统发育分析。
　　结果：
　　贵州茂兰捕获的3个鼠种中，社鼠Rattus niviventer的平均种内遗传距离为0.008，黄胸鼠Rattus flavipectus为0.001，锡金小鼠Mus pahari为0.002，小于最小种间遗传距离0.02。而社鼠和黄胸鼠的平均种间遗传距离为0.142，社鼠和锡金小鼠的平均种间遗传距离为0.185，黄胸鼠和锡金小鼠的平均种间遗传距离为0.210。分别用MP法和NJ构建分子系统进化树，两者得到的结果均具有相似的拓扑结构，茂兰地区常见3种鼠类所有个体各形成一个单系，节点支持率是100％。
　　黑瞎子岛地区41个鼠类样本COI基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对后，结果显示，相似性在99％-100％。对黑瞎子岛地区两对近缘种东方田鼠Microtusfortis和莫氏田鼠Microtus maximowiczii，红背□ Clethrionomys rufocanus和棕背□Clethrionomys rutilus COI基因序列进行分析，同一种鼠类不同个体的DNA条形码序列差异很小，为0.003～0.008，平均为0.005;种间差异则很大，为0.108-0.346，平均为0.258。平均种间遗传距离是种内遗传距离的51倍。NJ和MP法构建的系统发育树，聚类分析。结果显示，不同种类的鼠位于不同的分支，不同种属的鼠类区别明显。每一个单系分支对应一个特异的物种，节点支持率为100％。在分支长度上，种间分支较长，种内分支则很短。
　　黄岛口岸截获小鼠的COI基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对后，结果显示，相似性为99％-100％的序列均为小家鼠Mus musculus。初步提示黄岛口岸截获的小鼠很可能是小家鼠。黄岛口岸截获小鼠的COI序列与来自圭亚那、墨西哥、加拿大、美国和中国的10个小家鼠COI序列相似性为97％-100％。10个小家鼠COI序列归为高支持率的单系分支，分支内平均遗传距离为0.017，而同为鼠科的来自不同地区的褐家鼠Rattus norvegicus则归为另一支，两分支间遗传距离为24％。在进行种内遗传距离和系统发育分析时，我们还发现黄岛口岸截获的小家鼠与来自不同地区的小家鼠虽同属单系，但距离表现出微小差异。其中与来自中国的小家鼠距离相对较远，与来自美国和加拿大的小家鼠距离居中，而与来自圭亚那和墨西哥的小家鼠距离最近。这种距离的差异特点表现出明显的地域性。
　　结论：
　　对鼠类COI基因进行多重序列比对、遗传距离分析、序列聚类和系统发育构建能够很好的对鼠类进行分类和鉴定，可为鼠种DNA分类鉴定的一般模式提供参考。基于COI基因的DNA条形码不仅能够纠正形态学鉴定中的错误，还能鉴别形态相近的近缘种。DNA条形码技术能够很好鉴定国境口岸截获的腐烂小鼠，并能对国境口岸截获小鼠的地理来源作出初步判断。基于COI基因的DNA条形码技术能够方便、快捷、准确的鉴定鼠类。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 探索DNA条形码检测技术用于媒介鼠类鉴定的一般模式

1．1 材料

1．1．1 试剂

1．1．2 仪器

1．1．3 样品采集

1．2 方法

1．2．1 引物合成

1．2．2 基因组DNA提取

1．2．3 PCR扩增

1．2．4 序列测定

1．2．6 序列校正

1．2．7 BLAST比对

1．2．8 COI序列分析和系统树构建

1．3 结果

1．3．1 21个鼠类样品COI基因PCR扩增结果

1．3．2 COI基因片段的BLAST比对结果

1．3．3 COI基因序列分析

1．3．4 分子系统树

1．4 讨论

第二部分 DNA条形码技术对近缘种的鉴定

2．1 材料

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

1．1．3 样品采集

1．2 方法

2．2．1 基因组DNA提取

2．2．2 PCR反应和序列测定

2．2．3 COI序列分析和系统树构建

2．3 结果

2．3．1 41个鼠类标本COI基因扩增结果

2．3．2 COI基因的BLAST比对结果

2．3．3 种内与种间遗传距离

2．3．4 系统发育树构建

2．3 讨论

第三部分 DNA条形码技术鉴定国境口岸截获的腐烂鼠并追踪地理来源

3．1 材料

3．1．1 试剂

3．1．2 仪器

3．1．3 样品采集

3．2 方法

3．2．1 基因组DNA提取

3．2．2 PCR反应

3．2．3 纯化回收

3．2．4 对纯化产物进行再次扩增

3．2．5 序列测定

3．2．6 序列校正

3．2．7 BLAST比对

3．2．8 同属同种、同属异种和邻近属种序列的下载

3．2．9 COI序列分析和系统树构建

3．3 结果

3．3．1 腐烂小鼠COI基因扩增结果

3．3．2 COI基因的BLAST比对结果

3．3．3 两两比对的种内与种间遗传距离

3．3．4 平均种内遗传距离和平均种间遗传距离

3．3．5 系统发育树构建

3．4 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介及读研期间主要科研成果