低蛋白日粮添加支链氨基酸对仔猪采食量和骨骼肌生长的影响及调控机制研究

摘要

充足的底物浓度和平衡的氨基酸模式是猪骨骼肌高效蛋白质合成的必要条件。其中，采食量是保障充足的底物浓度的关键。除作为合成蛋白质底物外，支链氨基酸(branched chain amino acids，BCAAs)（包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）可能还发挥生物学调控作用。比如，缬氨酸能够调控猪采食量。此外，几乎所有谷氨酸和天冬氨酸以及大部分谷氨酰胺在肠道发生了分解代谢，导致不可逆的损失。骨骼肌蛋白质合成所需的这三个非必需氨基酸必须要由BCAAs代谢生成。而且BCAAs仅有部分被肠道和肝脏等器官截留。因此，通过日粮中添加BCAAs可能增加骨骼肌内自身代谢生成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸，优化胞内氨基酸模式，促进蛋白质合成。目前已有的研究表明，日粮添加BCAAs可以提高猪生长性能，但其对采食量及骨骼肌蛋白质沉积的调控机制尚待进一步阐明。　　本研究围绕BCAAs提高仔猪采食及骨骼肌生长的关键问题，通过两轮仔猪饲养试验证实了低蛋白日粮添加BCAAs通过提高采食量和直接促进肌肉生长，改善仔猪生长性能，并进一步阐明了下丘脑感应BCAAs调节仔猪采食量的机制。应用血插管结合代谢组学技术，研究了日粮BCAAs对摄食状态下骨骼肌的氨基酸净利用及代谢的影响，并探究了BCAAs代谢与肌肉氨基酸净利用的关系;应用血插管结合稳定同位素示踪技术，进一步阐明了BCAAs通过自身代谢调控骨骼肌蛋白质合成的机制。最后研究了日粮BCAAs对禁食状态下骨骼肌内调节蛋白质合成与降解的信号通路活性的影响。主要研究内容及结果如下:　　第一部分:通过两轮仔猪饲养试验研究了低蛋白日粮添加BCAAs对仔猪生长性能、采食量及骨骼肌生长的影响。在试验一中，选取28头断奶仔猪分为4个组，即正对照组、负对照组、试验1组以及试验2组，日粮粗蛋白水平依次为19.5％、16.7％、16.7％和17.2％。其中，试验1组在负对照组基础上添加缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸保证日粮中三种BCAAs水平与正对照组一致，并增加一倍的添加剂量形成试验2组的日粮。自由采食。试验二为配对试验，选取21头断奶仔猪分为3个组，即负对照组、试验1组以及配对组。其中，负对照组和试验1组同试验一。配对组试猪饲喂试验1组的日粮，但采食量与负对照组保持一致。28 d的饲养试验结束后，每组随机选择6头屠宰，测定胴体性状，采集下丘脑及背最长肌样。同时，剥离背最长肌等主要的23块肌肉，分别称量肌肉块重量。主要结果如下:　　1.与负对照组相比，试验1组和试验2组显著提高了平均日增重、末重、采食量、前躯、中躯和后躯肌肉总重、背最长肌等大多数肌肉块重量以及氮沉积(P＜0.05)，并能恢复到正对照组的水平。当采食量保持一致时，添加BCAAs的配对组仍能显著提高仔猪平均日增重和肉料比(P＜0.05)，并也显著提高了冈上肌、背阔肌、背最长肌等大块肌肉重量(P＜0.05)。　　2.与负对照组相比，日粮添加BCAAs以剂量依赖的方式上调下丘脑Agrp和NPY mRNA水平，下调MC4R mRNA水平，并在试验2组达到差异显著水平(P＜0.05)。此外，试验1组显著下调了CARTmRNA水平(P＜0.05)。回归分析显示，采食量随NPY mRNA水平增加呈二次曲线增加(P=0.02)，而随MC4R mRNA水平增加呈线性降低（P=0.02）。表明日粮添加BCAAs对采食量的提高与其上调下丘脑NPY基因表达以及下调MC4R基因表达有关。　　3.与负对照组相比，试验1组和试验2组显著降低了下丘脑eIF2α磷酸化水平，以及显著提高了S6K1磷酸化水平(P＜0.05)，并能恢复到正对照组的水平。此外，试验1组的mTOR磷酸化水平显著高于负对照组(P＜0.05)。表明日粮添加BCAAs对采食量的提高与其降低GAAC通路活性以及提高mTORC1通路活性有关。　　4.与负对照组相比，试验1组和配对组均显著提高了背最长肌S6K1和mTOR磷酸化水平(P＜0.05)，但试验1组和配对组之间差异不显著。说明BCAAs能够激活骨骼肌mTORC1通路活性，且不依赖于采食量的变化。　　第二部分:利用血插管结合代谢组学技术研究了日粮添加BCAAs对仔猪肌肉氨基酸净利用和股静脉代谢产物谱的影响。试验动物同第一部分的配对试验。28 d的饲养试验结束后，对负对照组及试验1组的试猪分别在股动脉、股静脉、颈动脉和颈静脉安装插管。在术后的第5d，每组各选择6头健康且插管通畅的试猪进行正式试验。通过股动脉持续9h灌注对氨基马尿酸(pAH)以测定肌肉血流速度。每隔1h饲喂以保持试猪始终处于摄食状态，连续饲喂8次。摄食前及摄食后每隔1h分别采集颈动脉和股静脉血样以供分析pAH、游离氨基酸及支链α酮酸，连续采集8次。待血样采集完成后屠宰，采集股二头肌样用于游离氨基酸及3-甲基组氨酸分析，股静脉血样同时进行代谢组学分析。主要结果如下:　　1.肌肉血流速度在摄食后显著提高了(P＜0.05)，但不受日粮处理的影响。日粮添加BCAAs显著增加了动脉和肌肉游离的异亮氨酸、亮氨酸以及缬氨酸浓度(P＜0.05)，但显著降低了动脉游离的苯丙氨酸和丝氨酸浓度以及肌肉游离的丝氨酸浓度(P＜0.05)。同时，添加BCAAs显著降低了肌肉游离的3-甲基组氨酸浓度(P＜0.05)，表明BCAAs抑制骨骼肌蛋白质动员。　　2.日粮添加BCAAs显著提高了总BCAAs、总必需氨基酸、总非必需氨基酸及总氨基酸的肌肉净利用量(P＜0.05)，从而维持高效的蛋白质沉积。此外，添加BCAAs显著增加了异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸及其代谢产物丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的肌肉净利用量(P＜0.05)，同时还显著增加了组氨酸、蛋氨酸以及甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸等功能性非必需氨基酸的肌肉净利用量(P＜0.05)。　　3.日粮添加BCAAs对股静脉代谢物有显著影响，这些差异化合物与BCAAs代谢和蛋白质合成相关。例如，添加BCAAs显著提高了三种支链α酮酸、谷氨酰胺以及天冬酰胺等代谢产物含量(P＜0.05);同时也显著提高了二十碳五烯酸等脂质代谢相关产物含量(P＜0.05)。进一步对产物定量的结果显示，添加BCAAs显著提高了KIC和KMV（分别为亮氨酸和异亮氨酸的转氨产物）的肌肉净生成量(P＜0.05)，提示添加BCAAs增加了骨骼肌内自身的代谢。　　4.肌肉氨基酸净利用量分别与动脉的亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸浓度呈显著正相关（P＜0.05），而与肌肉的BCAAs浓度之间无相关性。有趣的是，肌肉氨基酸净利用量分别与KIC和KMV净生成量呈显著正相关(P＜0.05)。这些结果暗示添加BCAAs可能通过增加动脉浓度及胞内自身代谢来提高肌肉氨基酸净利用量。　　第三部分:利用血插管结合稳定同位素示踪技术研究了日粮BCAAs通过调控自身代谢影响仔猪骨骼肌蛋白质合成与降解的机制。摄食状态下机制研究的试验动物同第二部分试验。在试猪第一次采食完，通过颈静脉灌注NaH13CO3，持续2h。随后灌注[1-13C]亮氨酸，持续6h。pAH灌注以及血样采集同第二部分试验。血样用于分析亮氨酸、KIC和CO2浓度及其同位素丰度。禁食状态下机制研究的试验动物同第一部分试验的试验一。采集负对照组和试验1组的背最长肌样。主要结果如下:　　1.日粮添加BCAAs显著提高亮氨酸的动脉摄入量和净利用量(P＜0.05)，从而显著提高蛋白质合成量以及沉积量(P＜0.05)。添加BCAAs也显著增加净转氨量（P＜0.05），但不影响氧化脱羧量。有趣的是，蛋白质降解在添加BCAAs后亦显著增加了(P＜0.05)。进一步的代谢命运分析显示，肌肉摄取亮氨酸约有30％发生代谢，并主要经转氨作用生成KIC。　　2.肌肉的[1-13C]亮氨酸净摄取以及[1-13C]KIC净生成在日粮添加BCAAs后也显著提高了（P＜0.05）。相关分析显示，骨骼肌蛋白质合成分别与蛋白质降解及[1-13C]KIC净生成之间呈显著正相关(P＜0.05)，暗示日粮BCAAs可能通过增加蛋白质降解以及自身的转氨代谢，提高摄食状态下蛋白质合成。　　3.日粮添加BCAAs显著提高了背最长肌的Akt、mTOR及其下游靶蛋白S6K1的磷酸化水平（P＜0.05），提示饲喂BCAAs仔猪在禁食状态下骨骼肌具有更高的蛋白质合成能力。此外，添加BCAAs显著增加了FoxO1磷酸化水平(P＜0.05)，相应地下调了Atro gin-1、MuRF1以及LC3-Ⅱ蛋白的表达(P＜0.05)，提示饲喂BCAAs仔猪在禁食状态下骨骼肌呈现更低水平的蛋白质降解。　　本研究的主要结论为:(1)低蛋白日粮添加BCAAs可以提高采食量以及直接促进肌肉生长，从而改善仔猪生长性能，并能恢复到饲喂高蛋白日粮的水平;(2)日粮BCAAs可以通过影响下丘脑的食欲调节基因表达及通路活性，提高采食量;(3)日粮BCAAs通过促进自身在肌细胞内的代谢以及蛋白质降解，进而增加氨基酸净利用量，提高摄食状态下骨骼肌蛋白质合成速率;同时，日粮BCAAs通过下调泛素，蛋白酶体以及自噬-溶酶体途径的关键蛋白表达，抑制禁食状态下骨骼肌蛋白质降解，并最终提高蛋白质沉积，从而促进骨骼肌生长。

目录

声明

摘要

略缩语表

第一章 文献综述

1 前言

2 骨骼肌高效蛋白质合成的条件及其影响因素

2．1 采食量通过影响底物浓度调节骨骼肌蛋白质合成

2．2 氨基酸平衡模式影响骨骼肌蛋白质合成

2．3 肠道及肝脏的氨基酸代谢改变进入骨骼肌内的氨基酸模式

2．4 骨骼肌内支链氨基酸代谢是影响胞内氨基酸模式的主要因素

3 支链氨基酸与仔猪采食量

3．1 动物中枢神经系统感应氨基酸调节采食量的机制

3．2 支链氨基酸调节仔猪采食量的研究进展

4 骨骼肌蛋白质合成与降解的调控机制

4．1 摄食和禁食状态下骨骼肌蛋白质合成与降解的变化

4．2 摄食状态下骨骼肌蛋白质合成的调控机制

4．3 禁食状态下骨骼肌蛋白质降解的调控机制

5 支链氨基酸与仔猪骨骼肌生长

5．1 支链氨基酸调控仔猪骨骼肌蛋白质合成的研究进展

5．2 支链氨基酸调控仔猪骨骼肌蛋白质降解的研究进展

5．3 支链氨基酸代谢对骨骼肌蛋白质合成与降解的潜在调节作用

6 活体上研究骨骼肌氨基酸代谢的关键技术

6．1 股动脉-股静脉插管系统

6．2 血插管结合同位素示踪技术研究骨骼肌氨基酸代谢率及代谢命运

6．3 血插管结合代谢组学技术挖掘新的氨基酸代谢产物

7 研究的目的与意义

第二章 低蛋白日粮添加支链氨基酸对仔猪生长性能、采食量及骨骼肌生长的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验动物与分组

2．2 试验日粮

2．3 饲养管理

2．4 氮平衡试验

2．5 仔猪生长性能

2．6 仔猪屠宰及样品采集

2．7 测定指标与分析方法

2．8 数据处理及统计

3 结果与分析

3．1 生长性能

3．2 氮平衡

3．3 胴体性状

3．4 肌肉块重量

3．5 下丘脑食欲调节基因的mRNA表达

3．6 下丘脑的一般性氨基酸应答通路活性

3．7 下丘脑的雷帕霉素靶蛋白通路活性

3．8 背最长肌的雷帕霉素靶蛋白通路活性

4 讨论

第三章 低蛋白日粮添加支链氨基酸对仔猪肌肉氨基酸净利用及代谢的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验动物与分组

2．2 仔猪股动脉-股静脉-颈动脉-颈静脉插管系统的安装

2．3 pAH灌注和样品采集

2．4 测定指标与分析方法

2．5 代谢组学分析

2．6 肌肉血流速度的计算

2．7 肌肉氨基酸净利用量的计算

2．8 肌肉BCKAs净生成量的计算

2．9 数据处理及统计

3 结果与分析

3．1 血插管安装及术后恢复情况

3．2 肌肉血流速度

3．3 动脉血浆游离氨基酸浓度

3．4 肌肉游离氨基酸及3-MH浓度

3．5 肌肉氨基酸净利用量

3．6 股静脉代谢物谱

3．7 肌肉支链α酮酸净生成量

3．8 肌肉氨基酸净利用量与动脉和肌肉游离BCAAs浓度及BCKAs净生成量的相关关系

4 讨论

4．1 股动脉-股静脉插管系统的优势

4．2 肌肉氨基酸净利用

4．3 底物浓度对肌肉氨基酸净利用的调控

4．4 BCAAs作为信号分子对肌肉氨基酸净利用的调控

4．5 骨骼肌内BCAAs代谢对肌肉氨基酸净利用的调控

第四章 日粮支链氨基酸通过调控自身代谢影响摄食和禁食状态下仔猪骨骼肌蛋白质合成与降解的机制

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验动物与分组