三磷酸甘油脱氢酶基因和甘油代谢对拟南芥种子含油量与根系发育的影响

摘要

种子含油量是油料作物研究的主要性状之一。三酰甘油是油料作物种子中贮藏性油脂的主要形式。三酰甘油由三磷酸甘油作为骨架逐步与三个脂肪酸分子结合而成。前人对含油量的调控研究主要集中在参与脂肪酸合成与利用途径中的有关基因，而很少有三磷酸甘油对种子油份积累的报道。三磷酸甘油在植物细胞中主要由两条路径产生，其一，甘油激酶磷酸化甘油产生三磷酸甘油;其二，三磷酸甘油脱氢酶将磷酸二羟丙酮加氢还原生成三磷酸甘油。近期研究表明，在种子中过表达酵母三磷酸甘油脱氢酶基因能提高油菜种子含油量。甘油广泛存在于微生物，动物和植物中。甘油代谢有关机制相对保守，其在微生物和藻类等已有较多报道，但在高等植物中有关甘油代谢对植物生长发育影响的报道较少。根系是高等植物的重要器官，也是植物发育生物学研究的模式器官之一。利用拟南芥研究甘油对植物根系生长发育将有助于甘油代谢机理的全面认识。　　本研究包括两方面的内容:第一部分是过表达甘蓝型油菜三磷酸甘油脱氢酶基因对种子油份积累等性状的影响;第二部分是利用甘油代谢相关突变体与三磷酸甘油脱氢酶过表达材料比较外源甘油对拟南芥根系发育的影响，主要结果如下:　　1、利用同源基因克隆法获得了甘蓝型油菜两个GPDH基因。SouthernBlot分析油菜BnGPHp1克隆片段在甘蓝、白菜和甘蓝型油菜中的基因拷贝数分别为2个、2个和4个。氨基酸序列对比发现，BnGPDHs含有三磷酸甘油脱氢酶两个典型的结构域，且与甘蓝、白菜及拟南芥GPDHs基因氨基酸序列有高度同源性。生物信息软件预测克隆片段BnGPDHp1与BnGPDHc1分别定位于质体与胞质中。　　2、基因表达分析显示BnGPDHs在花、蕾中表达量较高，在根和茎中表达量较低，在发育的种子中均有表达。过表达BnGPDHp1转化大肠杆菌甘油营养缺陷型菌株后重组菌系能在缺甘油的基础培养基上生长。　　3、构建BnGPDHs过表达载体并转化拟南芥，对转化家系进行插入拷贝数分析与目的基因表达分析，选取其中5个家系进行表型分析。发现多数过表达家系在种子重量、种子含油量同野生型比较时增加差异并不明显。构建Dsred-BnGPDHp1种子特异性过表达建构转化拟南芥，选取转基因后代阳性和非阳性种子进行比较，发现过表达家系在种子重量、种子含油量同非阳性对照比较无明显差异。对过表达家系与对照在不同胁迫条件下处理后的鲜重和种子萌发率进行比较，显示过表达BnGPDHp1增强了植物抗盐胁迫能力。　　4、鉴定了两个甘油代谢有关纯合突变体gpdhp1，gpdhc1，并利用这些突变体获得了双突变体gpdhc1gpdhp1。RNA表达分析显示目的基因在相应材料中均被敲除。种子重量比较发现，突变体gpdhc1比野生型要高，gpdhp1与野生型差异不显著，双突变体gpdhc1gpdhp1显著下降。种子含油量比较发现，突变体gpdhp1比野生型要高，gpdhc1与野生型差异不显著，双突变体gpdhc1gpdhp1与无明显差异。单粒种子油份比较发现，两个单突变体比野生型显著增加，但是双突变体无明显差异。　　5、在梯度甘油条件下处理拟南芥幼苗，发现随着甘油浓度增加拟南芥根长生长逐渐受抑制。1mM甘油浓度以上根长抑制明显，且侧根数目显著增加。在1mM甘油处理下甘油激酶突变体gli1根系变化不明显，三磷酸甘油脱氢酶突变体gpdhc1和fad-gpdh的根长减少程度比野生型更明显。过表达FAD-GPDH家系在甘油处理下根长不变或略有减少。　　6、上述根系生长变化的表型同时伴随着体内三磷酸甘油含量上升与无机磷含量下降。甘油处理下突变体gli1三磷酸甘油与无机磷含量没有变化。三磷酸含量升高引发野生型、gpdhc1和fad-gpdh突变体幼苗中的过氧化氢含量增加。过表达FAD-GPDH消除了处理下三磷酸甘油、无机磷含量和过氧化氢含量的变化，导致过表达植物对外源甘油耐受能力增强。这些结果说明甘油造成的根系生长变化与三磷酸甘油、磷和过氧化氢含量的改变有关，也说明FAD-GPDH基因在调控甘油代谢中发挥着重要作用。　　7、甘油处理下游离IAA含量增加46％，DR5pro∷GUS在根分生区的中柱细胞着色增强，PIN1和PIN7基因表达降低，PIN7∷GUS染色和PIN7pro∷PIN7-GFP荧光在处理下减弱，显示甘油处理下根中极性生长素转运下调。对生长素相关突变体分析显示TIR1和ARF7调节甘油处理下根的生长。　　8、甘油条件下拟南芥根分生区长度和细胞数目减少，CYCB1;1pro∷GUS着色的细胞数目减少。而且处理下幼根中CDKA和CYCB1基因表达显著降低，暗示甘油处理下细胞周期进程发生变化。

目录

声明

摘要

缩写词表(Abbreviations)

前言

1 种子油脂合成与积累相关研究进展

1．1 乙酰辅酶A羧化酶基因对种子含油量的调控

1．2 肯尼迪途径中的酶对种子含油量的调控

1．3 碳分配与种子含油量

1．4 转录因子与种子含油量

1．5 油体蛋白与种子含油量

1．6 影响种子含油量的其他因素

2 甘油代谢及有关研究进展

2．1 植物三磷酸甘油脱氢酶分类及其催化的反应

2．2 三磷酸甘油脱氢酶的结构特点

2．3 植物中三磷酸甘油脱氢酶基因有关功能研究

3 根系生长发育相关研究进展

3．1 生长素信号影响根发育多个阶段

3．2 细胞周期基因参与根生长发育

3．3 氧化还原平衡影响根生长发育

3．4 营养元素调节根生长发育

4 本研究目的与意义

第一章 甘蓝型油菜三磷酸甘油脱氢酶基因克隆及功能分析

1 研究背景

2 材料与方法

2．1 主要实验材料

2．2 生化试剂与试剂盒

2．3 引物与测序分析

2．4 主要实验方法与步骤

3 结果

3．1 基因克隆与序列分析

3．2 组织表达分析

3．3 拷贝数分析

3．4 转化大肠杆菌突变菌株验证

3．5 构建过表达载体与转化农杆菌

3．6 转基因家系插入拷贝数检测

3．7 目的基因表达分析

3．8 种子有关性状比较

3．9 种子特异性过表达BnGPDHp1家系

3．10 油菜BnGPDHs家系胁迫处理

3．11 拟南芥中甘油代谢有关突变体生长状况与表达检测

3．12 突变体T-DNA插入拷贝数分析

3．13 三磷酸甘油脱氢酶突变体有关种子性状比较

4 讨论

4．1 三磷酸甘油脱氢酶基因序列与进化分析

4．2 三磷酸甘油脱氢酶调控甘油脂途径

4．3 三磷酸甘油脱氢酶与抗逆胁迫途径

5 本章小结

第二章 甘油代谢基因对拟南芥根发育调控的生化和分子基础

1 研究背景

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 外源甘油抑制主根生长改变侧根发育

3．2 甘油代谢有关基因参与甘油对根生长的影响

3．3 甘油处理下根生长变化与幼苗中三磷酸甘油含量累积有关

3．4 过表达FAD-GPDH消除甘油对根系生长的影响

3．5 甘油处理下细胞内无机磷和过氧化氢含量变化

3．6 甘油影响根尖生长素分布和内源IAA含量

3．7 甘油影响生长素转运基因PINs表达和活性

3．8 甘油影响根发育需要生长素有关基因参与

3．9 甘油处理使分生区细胞数目减少

4 讨论

4．1 三磷酸甘油与FAD-GPDH在甘油代谢中起着关键作用

4．2 甘油处理下的磷含量变化

4．3 甘油影响根系生长至少部分不依赖于外源蔗糖

4．4 甘油代谢引发氧化还原信号变化可能影响根系生长

4．5 甘油代谢影响生长素转运

4．6 甘油对根尖细胞分生活性的影响

5 本章小结

参考文献

附录

附录1 拟南芥甘油代谢有关T-DNA突变体信息

附录2 过表达载体建构相关信息

附录3 本研究所用引物序列信息

附录4 Southern杂交程序

附录5 作者简介和在读期间发表的论文

致谢