黄曲霉毒素B1去除菌的筛选及其在白酒糟中的初步应用

摘要

黄曲霉毒素（AFT）是一类真菌产生的有毒次级代谢产物，被世界卫生组织（WHO）划分为I类致癌物。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性居首位。目前，黄曲霉毒素污染已经成为一个全球性问题，在我国的情况尤为严重。酒糟作为一种优良的饲料来源，近年来被广泛应用为饲料添加剂。然而，其储存不当极易受AFB1的污染，而被污染的酒糟如果不经处理，会通过食物链最终进入动物性食品和人体，危害食品安全和人类健康。如何高效去毒已经成为制约酒糟饲料化应用的一大障碍。目前，利用生物法进行污染饲料脱毒是该领域的研究热点。本文首先从环境中分离、筛选能够去除AFB1的优良菌株，然后将其应用于AFB1污染的白酒糟固体发酵过程中，并探索能使该菌对AFB1去除率达到最大的发酵条件，希望能通过该菌株的作用将有毒白酒糟转化为安全低毒饲料，从而为白酒糟的饲料化安全应用消除障碍。本文主要研究结论如下：　　1.从土壤中筛选到一株能够去除AFB1的菌株—克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae），其菌液与AFB1共同反应后，去毒率可达48.52%。研究还发现该菌株主要是通过细胞发挥去毒作用，细胞经加热和2mol/L的浓盐酸处理后，细胞去毒率由处理前的35.23%分别提升至52.25%和45.46%。　　2.从样品提取、净化、液相色谱检测条件等方面进行优化，建立了系统的白酒糟AFB1液相色谱(HPLC)检测方法：取白酒糟样品粉末20g,按1:5（W/V）的比例加入100mL70%甲醇，同时加入5gNaC l，超声提取30min,超声功率为500W,过滤，调整滤液pH为7，滤液经免疫亲和柱净化，收集液水浴氮气吹干，加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸室温下衍生30min，水浴氮气吹干，加入乙腈复溶，HPLC检测，液相检测条件如下，荧光检测器最大激发波长为360nm；最大发射波长为440nm。流动相为体积比为1：3：6的甲醇-乙腈-水三相体系。流速为0.6mL/min，柱温30℃，进样量为20μL。　　在此色谱条件下，以浓度为5μg/L至500μg/L标准品衍生后建立的标准曲线线性良好，相关系数达到0.9999。加标量为10μg/L、20μg/L、50μg/L的酒糟样品经此方法检测后回收率均在85%以上，按三倍的信噪比确定的该方法检测限为1.5ng/mL，RSD值均小于5%，各项条件均符合国家规定，说明该方法准确可信。　　3．将克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）应用于AFB1污染的白酒糟中进行固态发酵，并探索其最优脱毒条件如下：温度为35℃，pH为7，接种量为10%，发酵时间为72h条件下，菌株对白酒糟AFB1去除率达到最大值41%。

目录

声明

1 前言

1.1黄曲霉毒素简介

1. 1. 1黄曲霉毒素的化学结构及性质

1. 1. 2黄曲霉毒毒素的危害

1.1.3我国饲料黄曲霉毒素B1污染现状

1.2饲料中黄曲霉毒B1的检测方法

1.2.1 薄层层析法（TLC）

1. 2. 2 酶联免疫吸附法

1.2.3 高效液相色谱法（HPLC）

1.3 饲料防霉及黄曲霉毒素B1的去除

1. 3. 1 饲料防霉

1. 3. 2 饲料去毒

1.4白酒糟的营养价值和应用现状

1. 4. 1白酒糟的营养价值

1. 4. 2白酒糟的应用现状

1.5课题研究的主要目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2. 1. 1 用于筛选菌株的样品

2. 1. 2 主要仪器设备

2. 1. 3 培养基

2. 1. 4 主要试剂

2. 1. 5主要药品及材料

2.2实验方法

2.2.1 AFB1去除菌的筛选和鉴定

2. 2. 2 菌株去除AF B1作用机制的研究

2.2.3白酒糟中AFB1含量高效液相（HPLC）检测方法的研究

2. 2. 4影响菌株去除白酒糟中AF B1效果的单因素实验

3 结果和分析

3.1 去除AFB1菌株的筛选结果

3. 1. 1 初筛结果

3. 1. 2 复筛结果

3.2 菌株发挥去毒作用机制的研究结果

3. 2. 1 发挥去毒活性成分的确定

3. 2. 2 不同处理方式对细胞去除AF B1作用的影响结果

3.3白酒糟黄曲霉毒素B1的HPLC检测方法的确定

3. 3. 1 液相色谱检测条件的优化结果

3. 3. 2 白酒糟样品提取净化过程的优化结果

3. 3. 3衍生化结果

3. 3. 4 加标回收实验及精密度实验结果

3.4去毒菌株在白酒糟的初步应用

3. 4. 1 发酵时间对白酒糟AF B1去除率的影响结果

3. 4. 2发酵温度对白酒糟AF B1去除率的影响结果

3. 4. 3 接种量对白酒糟AF B1去除率的影响结果

3.4.4 pH对白酒糟AFB1去除率的影响结果

4 讨论

5 展望

参考文献

致谢