黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选鉴定及其降解机理初步研究

摘要

黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前已发现的黄曲霉毒素中毒性最强的一种，其具有强肝毒性、高致突变性和高致畸性。广泛存在于农产品及饲料食品中，对人类健康存在严重威胁，同时对粮食和畜牧业造成严重的经济损失。　　AFB1具有非常稳定的理化性质，一般食品加工过程难以对其造成破坏。相对于物理法和化学法而言，生物降解AFB1反应条件较温和，不易造成营养的流失，也不会有产生新的毒素。细菌降解AFB1是一种有效、安全和环保的解毒方法。目前，生物降解AFB1的应用较少，尚未发现生物酶降解AFB1的相关应用。因而，分离高效降解AFB1的细菌具有重要的实际应用价值。本研究在筛选及鉴定高效降解AFB1的细菌菌株的基础上，优化降解AFB1的条件，并初步探讨其降解AFB1的作用机理，得到以下结果：　　（1）采用间接竞争ELISA方法测定培养液中AFB1含量，所得标准曲线相关系数＞0.9990，加标回收率＞98%，精密度＜5%。在2.5μg/kg~75μg/kg范围内线性较好。说明本实验所建立的方法简单便捷、准确可靠。适用于培养液中AFB1的检测。　　（2）使用香豆素代替AFB1做为唯一碳源，对AFB1降解菌株进行初筛实验，通过添加AFB1标准溶液，进行复筛实验。实验共计得到9株具备去除AFB1能力的菌株，其中去除能力最高的为鱼肠中分离出的YC2菌株。对YC2菌株细胞进行洗脱萃取，并测定细胞中AFB1的剩余量，确定了该菌株去除AFB1的过程为降解反应。　　（3）结合形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA基因序列测定分析对降解AFB1活性最高的菌株YC2进行鉴定。菌落呈现乳白色的圆形菌落，边缘整齐且薄，菌体中央微隆起，呈丘状，革兰氏阳性杆菌。并经过16S r RNA测序及系统进化树分析，初步确定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。　　（4）YC2菌株降解黄曲霉毒素B1条件的研究。比较了pH、温度、培养时间和金属离子对YC2菌株降解活性的影响，结果表明：YC2菌株从鱼肠中分离出的YC2菌株对黄曲霉毒素 B1的降解反应最佳条件为：pH 7，温度为35℃左右，培养时间为72h，不添加金属离子。　　（5）通过测定发酵上清液、胞内液等对AFB1的将降解能力，发现上清液降解AFB1的能力最高，为82.6%。由此判断该菌株分泌了一种胞外物对黄曲霉毒素B1进行降解。而上清液经热处理及蛋白酶K处理后，其AFB1降解率显著降低。因此，推测主要是YC2分泌的一种胞外蛋白酶起到了降解AFB1的作用。

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1前言

1.1黄曲霉毒素的概述

1.1.1种类于结构

1.1.2理化性质

1.1.3毒性与代谢

1.1.4黄曲霉毒素的危害

1.1.5黄曲霉毒素在食品中的分布

1.1.6黄曲霉毒素的限量标准

1.1.7黄曲霉毒素对经济的影响

1.2黄曲霉毒素的检测方法

1.2.1薄层层析法

1.2.2高效液相色谱法

1.2.3酶联免疫法

1.3黄曲霉毒素的去毒方法

1.3.1物理法去除黄曲霉毒素

1.3.2化学法去除黄曲霉毒素

1.3.3生物法去除黄曲霉毒素

1.4本课题研究的目的和意义

1.5本课题研究的主要内容

2.1试验材料

2.2实验试剂

2.3主要仪器与设备

2.4主要试剂及培养基制备

2.5技术路线

2.6实验方法

2.6.1 AFB1的测定

2.6.2 AFB1降解菌株的分离筛选

2.6.3 AFB1降解菌株的鉴定

2.6.4 YC2菌株降解AFB1的条件优化

2.6.5 YC2菌株各活性组份对AFB1的降解

2.6.6 YC2菌株降解AFB1活性组份性质的研究

3.1 AFB1的测定

3.1.1 AFB1标准曲线

3.1.2精密度实验

3.1.3回收率实验

3.2 AFB1降解菌株的分离筛选

3.2.1菌株初筛结果

3.2.2降解菌的复筛结果

3.2.3降解作用与吸附作用的区分

3.3 AFB1降解菌株的鉴定

3.3.1菌株的形态学特征

3.3.2菌株的生理生化特征

3.3.3 菌株的分子鉴定结果

3.4 YC2菌株降解AFB1的条件优化

3.4.1温度对YC2菌株降解AFB1的影响

3.4.2 pH条件对YC2菌株降解AFB1的影响

3.4.3培养时间对降解菌株去除AFB1的影响

3.4.4金属离子对YC2菌株降解AFB1的影响

3.5 YC2菌株降解AFB1作用机理的研究

3.5.1菌株各活性组分对AFB1降解率的确定

3.5.2菌株降解AFB1活性组分性质的研究

4.1 讨论

4.1.1 AFB1的测定方法的建立

4.1.2 AFB1降解菌株的分离筛选

4.1.3 AFB1降解菌株的鉴定

4.1.4 YC2菌株降解AFB1的条件优化

4.1.5 YC2菌株各活性组分对AFB1的降解

4.2结论

4.3 本研究创新之处

4.4 展望

致 谢