牛粪静态好氧堆肥中反硝化细菌群落结构的研究

摘要

堆肥化技术是资源化、减量化和无害化处理牛粪和秸秆的主流技术。为了克服传统堆肥生产周期长和产品质量不稳定等缺点，本文采用了一种新型的静态好氧高温堆肥技术。反硝化细菌是反硝化过程的驱动力，可导致氮素流失并造成污染环境，在堆肥过程中扮演重要角色。因此，对反硝化细菌群落开展研究有助于加深对堆肥氮循环理论的理解，并且有助于改进堆肥技术。　　本文测定堆肥过程中理化指标和生物学指标（温度、pH、含水率、总有机碳、凯氏氮、碳氮比、铵态氮含量、硝态氮含量、铵态氮与硝态氮比值以及种子发芽指数），通过高通量测序技术分析牛粪秸秆堆肥过程中反硝化细菌的群落结构和多样性变化，应用Spearman相关性热图分析堆肥中优势反硝化细菌菌属与环境因子之间的相关性。主要研究结果如下:　　(1)本研究堆肥化共持续17天，第4天进入高温期，并维持高温14天。通过综合评价pH、含水率、总有机碳(TOC)、凯氏氮(TKN)、C/N、铵态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）、NH4+-N/NO3--N比值和种子发芽指数(GI)指标，结果表明采用该新型堆肥技术处理的堆肥产品达到腐熟。　　(2)利用高通量测序技术分析了牛粪和秸秆混合堆肥过程中nirK细菌群落动态变化，结果分析表明在堆肥前期反硝化细菌群落丰富度最大，通过Alpha多样性分析表明不同时期堆肥样品反硝化细菌多样性指数存在差异，堆肥前期反硝化细菌群落多样性最高，堆肥后期较低。通过Beta多样性分析结果表明堆肥不同时期样本间反硝化细菌群落结构差异显著。　　(3)在门分类水平上对牛粪和秸秆混合堆肥中nirK型反硝化细菌群落结构组成分析，结果表明在堆肥中反硝化细菌主要为变形菌门(Proteobacteria)。Unclassified的反硝化细菌占比也比较多，表明在堆肥中存在大量未探明的反硝化细菌。在堆肥前期nirK型反硝化细菌主要是β-变形菌纲(Alphaproteobacteria)，随着堆肥进程，β-变形菌纲(Betaproteobacteria)相对丰度逐渐减少，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)逐渐占主导位置。从目分类水平分析，优势菌属主要属于根瘤菌目(Rhizobiales)、红杆菌目（Rhodobacterales）和伯克氏菌目(B urkholderiales)，其中根瘤菌目(Rhizobiales)的种类最多，但是伯克氏菌目(Burkholderiales)的相对丰度最高。在堆肥过程中，Rhizobiales相对丰度整体呈逐渐上升的趋势，在腐熟期达到最高。在初始期和升温期Burkholderiales相对丰度较大，并且是这两个时期的优势种群，随着温度的升高，其相对丰度逐渐降低，进入腐熟期后又略微上升。Rhodobacterales主要存在于堆肥初始期，随着堆体温度上升相对丰度逐渐减少，在高温期达到0.19％，在堆肥后期降低为0.01％。从属分类水平分析，堆肥中大多数优势菌属都为未探明的反硝化细菌。　　(4)Spearman相关性分析表明，除了unclassified_Alcaligenaceae和Ochrobactrum剩余10个nirK型反硝化细菌优势菌属变化与环境指标相关。Unclassified_k_norank_d_Bacteria和unclassified_o_Rhizobiales与TOC、C/N、含水率、pH呈负相关，与TKN、NO3--N、GI呈正相关，其他8个优势菌属与TOC、C/N、含水率、pH呈正相关，与TKN、NO3--N、GI呈负相关。Unclassified_o_Rhizobiales与NH4+-N之间呈极显著负相关(p＜0.001)，unclassified_p_Proteobacteria与NH4+-N之间呈极显著正相关(p＜0.001)，Pusillimonas与NH4+-N之间呈极显著正相关(p＜0.001)，Paracoccus与NH4+-N之间呈显著正相关（p＜0.05）。所有优势菌属与温度不相关。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 农业废弃物现状

1．2 堆肥化技术

1．2．1 堆肥化的过程

1．2．2 堆肥主要腐熟度指标

1．2．3 堆肥化技术存在的问题

1．3 堆肥中反硝化细菌的研究现状

1．3．1 氮素循环与反硝化过程

1．3．2 反硝化细菌功能基因的种类与功能

1．4 堆肥中反硝化细菌群落结构的生物学研究方法

1．4．1 变性梯度凝胶电泳

1．4．2 荧光定量PCR

1．4．3 末端限制性片段长度多态性分析

1．4．4 高通量测序

1．5 研究目的与意义

1．6 技术路线图

2 材料与方法

2．1 堆肥材料与预处理

2．2 实验设计

2．2．1 堆肥装置

2．2．2 取样方法

2．2．3 理化参数测定

2．2．4 堆肥nirK型反硝化细菌群落动态的研究

2．2．5 数据处理与分析

3 结果与分析

3．1 理化指标的变化

3．1．1 温度

3．1．2 pH

3．1．3 含水率

3．1．4 总有机碳和凯氏氮以及C／N值

3．1．5 NH4+-N和NO3--N以及NH4+-N／NO3--N

3．1．6 种子发芽指数

3．2 堆肥样品DNA提取与PCR结果

3．2．1 堆肥样品DNA纯化胶图和浓度

3．2．2 堆肥样品PCR扩增结果

3．3 nirK型反硝化细菌群落Alpha和Beta多样性分析

3．3．1 nirK型反硝化细菌群落Alpha多样性分析

3．3．2 堆肥中nirK型反硝化细菌群落Beta多样性分析

3．4 堆肥中nirK型反硝化细菌群落结构组成分析

3．4．1 堆肥中nirK型反硝化细菌门水平分类

3．4．2 堆肥中nirK型反硝化细菌目水平分类

3．4．3 堆肥中nirK型反硝化细菌属水平分类

3．5 nirK型反硝化细菌的系统发育进化树分析

3．6 nirK型反硝化细菌与环境因子相关性分析

4 讨论

4．2 堆肥中nirK型反硝化细菌群落组成变化

4．3 堆肥中nirK型反硝化细菌与环境因子相关性分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文