CRISPR/Cas9系统介导叙利亚金黄仓鼠Myh6基因敲除扩张型心肌病研究

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中英文缩略词

1 引言

1.1 背景与目的

1.2 实验动物选择

1.3 技术与方法

1.4 论文结构

1.5 实验结果

1.6 研究意义

2 Myh6 基因CRISPR/Cas9 编辑系统构建

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法

2.2.1 Myh6 基因敲除guide-RNA 位点选择及PCR 设计

2.2.2 px458 重组载体构建

2.3 实验结果

2.3.1 guide-RNA 位点设计结果

2.3.2 px458 重组载体构建

2.3.3 px458载体转染BHK21 细胞

2.3.4 体外效率验证

2.4 实验讨论

3 Myh6 基因敲除叙利亚金黄仓鼠模型构建

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 实验试剂、耗材及设备

3.2 实验方法

3.2.1 雄性叙利亚金黄仓鼠的处理

3.2.2 雌性叙利亚仓鼠的处理

3.2.3 受精卵采集

3.2.4 叙利亚仓鼠单细胞显微注射

3.2.5 叙利亚仓鼠受精卵移植

3.2.6 F0 代Myh6 基因基因型鉴定

3.2.7 脱靶分析设计

3.3 实验结果

3.3.1 CRISPR/Cas9 系统在金黄仓鼠受精卵内成功发挥作用

3.3.2 F0 代叙利亚金黄仓鼠出生情况统计

3.3.2 F0 代基因组酶切反应及PCR 测序鉴定

3.3.3 T载体测序结果分析

3.3.4 脱靶性分析

3.3.5 种系建立

3.4 实验讨论

4 Myh6 基因敲除模型表型分析

4.1 实验材料与仪器

4.2 实验方法

4.2.1 心脏B超检查

4.2.2 组织采集及固定

4.2.3 RNA 提取

4.2.4 实时荧光定量PCR 反应（qRT-PCR）

4.2.5 心脏蛋白提取

4.2.6 Western Blot 步骤

4.2.7 组织包埋及切片

4.2.8 HE 染色

4.2.9 Masson染色

4.2.10 统计方法

4.3 实验结果

4.3.1 纯合Myh6 基因敲除个体在胚胎期内死亡

4.3.2 Myh6 基因敲除对性别无影响

4.3.3 心脏B超显示Myh6 敲除鼠表现为扩张型心肌病症状

4.3.4 Myh6tv/+心肌组织未出现截短蛋白

4.3.5 Myh6tv/+突变导致心脏扩大

4.3.6 Myh6tv/+突变导致心肌纤维化及胶原沉积

4.3.7 Myh6tv/+个体心衰指标增高

4.4 实验讨论

5 阿霉素对Myh6 基因敲除模型心肌毒性的研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 药物配制

5.2.2 动物注射

5.2.3 透射电镜

5.3 实验结果

5.3.1 不同剂量阿霉素对WT鼠的生存分析

5.3.3 阿霉素处理下Myh6 敲除仓鼠左室收缩功能受损更严重

5.3.4 阿霉素加速了Myh6 敲除鼠心脏扩大

6.3.5 阿霉素造成Myh6tv/+个体心肌超微结构改变

5.4 实验讨论

结论及展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

综述:扩张型心肌病研究进展

参考文献

个人简历及攻读学位期间的研究成果

致 谢