microRNA--1266通过靶向调控DAB2IP对宫颈癌细胞生物学行为影响的研究

摘要

通过这一系列试验，我们希望进一步揭示宫颈癌的发病机制，以为其防治思路提供理论支持。　　第一部分:宫颈癌病人宫颈癌组织和血清中miR-1266的表达水平与其生存预后的关系研究　　目的：　　1.检测宫颈癌病人宫颈癌组织和血清中miR-1266的表达水平;　　2.探讨miR-1266与宫颈癌病人生存预后的关系。　　方法：　　1.宫颈组织标本的收集　　2.血清标本的收集　　3.所有宫颈癌患者均接受50个月随访，从手术日期到复发或死亡日期的间隔定义为随访期，最后一次随访是在2017年12月1日;　　4.采用实时荧光定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)检测宫颈组织和血清标本中miR-1266的表达水平;　　5.采用SPSS21.0和GraphPad Prism5.0软件进行数据的统计和分析，所有数据计量资料均采用(x)±s表示，数据行正态性检验。两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较经检验方差齐性后采用方差分析。采用Kaplan Meier法对宫颈癌患者进行生存预后分析。以α=0.05作为检验水准。　　结果：　　1.宫颈癌组和对照组宫颈组织中miR-1266的表达情况。　　宫颈癌组与对照组相比，miR-1266的表达水平是升高的，差异具有统计学意义(P＜0.05);　　2.宫颈癌组、HSIL组、LSIL组、健康对照组血清中的miR-1266表达情况。　　(1)宫颈癌组与健康对照组相比，miR-1266的表达水平是升高的，差异具有统计学意义(P＜0.05);　　(2)HSIL组与健康对照组相比，miR-1266的表达水平是升高的，差异具有统计学意义（P＜0.05）;　　(3)LSIL组与健康对照组相比，miR-1266的表达水平是升高的，差异具有统计学意义（P＜0.05）;　　3.Kaplan-Meier生存分析结果显示，50例宫颈癌患者中，低水平miR-1266病人组与高水平miR-1266病人组相比有较长的生存期，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　小结：　　miR-1266与宫颈癌患者的生存预后具有明显的相关性。　　第二部分:miR-1266通过靶向调控DAB2IP参与宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的体外实验研究　　目的:　　1.探讨miR-1266对宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的影响;　　2.探讨宫颈癌中miR-1266与DAB2IP之间的关系;　　3.探讨miR-1266是否能够通过靶向调控DAB2IP的表达，进而参与宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的调节。　　方法:　　1.通过TargetScan、miRDB、miRanda这三个生物学靶标预测网站分析miR-1266可能的下游靶标，并对数据结果进行Venn分析;　　2.采用Western blot技术检测宫颈癌组和对照组宫颈组织中DAB2IP蛋白的表达水平;　　3.采用Pearson相关系数分析宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP的相关性;　　4.采用双荧光素酶报告基因实验，将含有DAB2IP基因3'-端非编码区(UTR)野生型序列(WT-DAB2IP 3'-UTR)或突变型序列(MUT-DAB2IP 3'-UTR)的荧光素酶报告载体分别与miR-1266 mimics或miR-negative control (NC)共转染入宫颈癌细胞HeLa和SiHa，每种细胞分为4组:(mimics+WT)组、(mimics+MUT)组、(NC+WT)组、(NC+MUT)组。检测各组细胞的相对荧光素酶的活性，并验证预测结果;　　5.培养宫颈癌细胞系HeLa和SiHa，每种细胞分为3组:miR-1266模拟物组(mimics)、抑制物组(inhibitor)、阴性对照组(NC);采用CCK-8法、克隆形成实验、划痕修复实验和基质胶侵袭实验，检测各组细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力;　　6.培养宫颈癌细胞系HeLa和SiHa，采用脂质体Lipofectamine 2000转染DAB2IP过表达质粒，每种细胞分为3组:共转染miRNA-1266 mimics和DAB2IP过表达质粒组(mimics+plasmid)、共转染miRNA-1266 mimics和空白质粒组(mimics+control plasmid)、共转染miRNA-1266阴性对照物和DAB2IP过表达质粒组(NC+plasmid);采用Western blot法检测各组细胞DAB2IP的表达水平;采用CCK-8法、克隆形成实验、划痕修复实验和基质胶侵袭实验，检测各组细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力。　　7.采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据的统计和分析，所有数据计量资料均采用(x)±s表示，数据行正态性检验。两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较经检验方差齐性后采用方差分析。采用Pearson相关系数分析宫颈癌患者的宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP的相关性。以α=0.05作为检验水准。　　结果:　　1.宫颈癌组和对照组宫颈组织中的DAB2IP蛋白的表达情况。　　宫颈癌组与对照组相比，DAB2IP蛋白的表达水平是明显降低的，差异具有统计学意义(P＜0.05);　　2.宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP的关联。　　(1) Pearson相关系数分析发现，宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP蛋白的相对表达水平具有负向相关性，且相关系数r=-0.4255，差异具有统计学意义(P=0.0021);　　(2)生物信息学分析网站预测结果显示，DAB2IP的mRNA的3'-UTR区含有可以与miR-1266互补结合的序列，且序列是位于DAB2IP的mRNA的3'-UTR区的996位到1003位的核苷酸;　　(3)双荧光素酶报告基因实验结果显示，在宫颈癌细胞HeLa和SiHa中，(mimics+MUT)组与(NC+MUT)组相比，相对荧光活性均没有明显变化; (mimics+WT)组与(NC+WT)组相比，相对荧光活性均降低，差异具有统计学意义;　　3.转染miR-1266的模拟物或抑制物后，宫颈癌细胞HeLa和SiHa的生存、增殖、迁移和侵袭能力的变化。　　(1)模拟物组与阴性对照组相比，宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力均是升高的，差异具有统计学意义;　　(2)抑制物组与阴性对照组相比，宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移与侵袭能力均是降低的，差异具有统计学意义;　　4.共转染miRNA-1266 mimics和DAB2IP过表达质粒后，DAB2IP过表达实验中DAB2IP蛋白的表达水平和宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力的变化。　　(1)(mimics+plasmid)组与(mimics+control plasmid)组相比，DAB2IP蛋白的表达水平是升高的，差异具有统计学意义;(mimics+ plasmid)组与(NC+plasmid)组相比，DAB2IP蛋白的表达水平是降低的，差异具有统计学意义;　　(2) (mimics+plasmid)组与(mimics+control plasmid)组相比，宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移与侵袭能力是降低的，差异具有统计学意义; (mimics+plasmid)组与(NC+plasmid)组相比，宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移与侵袭能力是升高的，差异具有统计学意义。　　小结:　　miR-1266能够通过靶向调控DAB2IP的表达，进而促进宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭的能力。　　第三部分:miR-1266促进宫颈癌生长的体内实验研究　　目的:　　第二部分通过体外细胞实验已经明确miR-1266能够在宫颈癌细胞中发挥促癌作用，因此本部分进一步通过构建宫颈癌裸鼠移植瘤动物模型，探讨miR-1266能否在体内促进肿瘤的生长。　　方法:　　1.培养宫颈癌细胞系HeLa，转染miR-1266 mimics或阴性对照物;　　2.建立宫颈癌裸鼠动物模型　　3.注射后每4天监测裸鼠生长情况、饮食情况，测量移植瘤的体积大小及体重变化，持续28天，共7次;　　4.28天后处死裸鼠，取出宫颈癌瘤体，测量体积并称重，根据测量的瘤体体积绘制肿瘤生长曲线;　　5.采用qRT-PCR法检测宫颈癌瘤体内miR-1266的表达水平　　6.统计方法见第一部分。　　结果:　　1.宫颈癌瘤体的体积在实验组和对照组裸鼠中的大小情况。　　实验组与对照组相比，裸鼠形成的宫颈癌瘤体的体积较大，差异具有统计学意义;　　2.宫颈癌瘤体的重量在实验组和对照组裸鼠中的高低情况。　　实验组与对照组相比，裸鼠形成的宫颈癌瘤体的重量较高，差异具有统计学意义;　　3.miR-1266在实验组和对照组的宫颈癌瘤体组织中的表达情况。　　实验组与对照组相比，在裸鼠的宫颈癌瘤体中miR-1266的表达水平是升高的，差异具有统计学意义。　　小结:　　miR-1266在裸鼠体内发挥促癌作用，可能是宫颈癌潜在的治疗新靶点。

目录

声明

摘要

附图清单

附表清单

缩略词表

前言

第一部分宫颈癌病人宫颈癌组织和血清中miR-1266的表达水平与其生存预后的关系研究

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

5小结

第二部分miR-1266通过靶向调控DAB2IP参与宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的体外实验研究

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

5小结

第三部分miR-1266促进宫颈癌生长的体内实验研究

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

5小结

全文结论

本课题的创新点

参考文献

综述 microRNA在宫颈癌发病机制中的研究进展

个人简历、攻读博士学位期间发表的文章

致谢