MicroRNA-27a对糖尿病大鼠肾脏系膜细胞增殖及细胞外基质堆积的影响及机制研究

摘要

糖尿病肾病（Diabetes nephropathy，DN）是一个主要的糖尿病微血管并发症，是引起糖尿病患者慢性肾功能衰竭的最主要原因之一。DN病理变化主要包括系膜细胞异常增生及细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）过度堆积。在高糖状态下，肾小球系膜细胞（Mesangial cells, MCs）功能紊乱，引起ECM蛋白分泌和降解相对失衡而大量堆积于系膜区及基底膜区，使肾小球形态、结构及功能发生病理性变化，最终导致肾小球硬化症的发生。转化生长因子β（Transforming growth factor-β, TGF-β）在MCs合成及分泌ECM的过程中发挥重要作用。研究表明，高糖可激活MCs中TGF-β/Smad3信号转导通路，最终导致胶原 IV、纤连蛋白等多种 ECM成分合成增加，并促进 PAI-1（Plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）表达，从而抑制ECM降解。但是，目前对导致系膜细胞损伤的确切机制尚不十分清楚。　　microRNAs（miRNAs）是由21-25个核苷酸组成的非编码小RNAs，其可与靶基因 mRNA3′端非转录区域（3′-untranslated region，3′UTR）结合，通过促进mRNA降解或阻断蛋白翻译调节靶基因表达，从而调控机体病理生理过程。miRNAs在细胞增殖，生长，分化及凋亡中发挥重要作用。miRNAs在不同的组织表达不同，且其表达的变化参与人类多种疾病的发生发展，如肿瘤、心血管疾病、糖尿病、各种肾脏疾病等。近年大量研究表明，miRNAs与DN发生发展密切相关，肾脏特定 miRNAs改变可以多种方式促进疾病的进展，从纤维化通路的激活到肾脏解剖学结构改变引起蛋白尿。microRNA-27a（ miRNA-27a，miR-27a）主要在肾脏，皮下脂肪，肺及心脏中表达，参与细胞周期、增殖及分化的调节。研究表明miRNA-27a在1型和2型糖尿病患者的血清中表达升高，并与空腹血糖水平有较高的相关性；Herrera等运用微阵列分析发现在自发2型糖尿病大鼠脂肪组织及高糖培养的3T3-L1脂肪细胞中 miRNA-27a表达明显上调；此外研究发现 DN患者血清中 miRNA-27a明显升高，这些研究表明miRNA-27a在高糖环境下表达升高并且可能在糖尿病及 DN的病理生理过程中发挥重要作用。但是，目前国内外缺乏对miRNA-27a与DN肾小球MCs损伤的研究。　　过氧化物酶体增殖体激活受体-γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ， PPARγ）是核受体超家族成员之一，在调节肾小球系膜细胞增殖，细胞周期及糖尿病肾小球细胞外基质合成及降解中发挥重要作用。大量研究表明，PPARγ水平增加能够抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞及糖尿病动物模型肾脏TGF-β1的表达，减少PAI-1水平，从而抑制ECM的聚集；并且PPARγ表达升高可改善高糖诱导的系膜细胞增殖和肥大。因此增加PPARγ表达可能阻止肾小球硬化。研究表明 PPARγ是 miRNA-27a的一个潜在靶基因，其3′-UTR端包含一个保守的miRNA-27a结合位点。在低氧处理的人肺动脉内皮细胞中，miRNA-27a表达升高并可直接与PPARγ3′-UTR结合，负性调节其mRNA和蛋白表达水平，导致细胞增殖增加；抑制miRNA-27a表达则可以明显增加PPARγ表达，从而抑制细胞增殖。另外，miRNA-27a可通过靶向结合PPARγ3′-UTR调节抑制脂肪细胞分化。因此我们推测，miRNA-27a可能通过调节肾脏PPARγ水平影响系膜细胞增殖及细胞外基质堆积，为此，本实验开展以下研究。　　第一部分 miRNA-27a在高糖培养的肾小球系膜细胞及糖尿病大鼠肾皮质中的表达研究　　目的：　　观察高糖培养的肾小球系膜细胞及糖尿病大鼠肾皮质中 miRNA-27a的表达，初步探讨miRNA-27a与系膜细胞增殖和细胞外基质堆积的关系。　　方法:　　1．高浓度葡萄糖（25 mmol/L, HG）分别刺激大鼠肾小球系膜细胞（MCs）24、48、72 h，以葡萄糖浓度（5.6 mmol/L, NG）培养的MCs为正常对照组，TaqMan探针实时荧光定量PCR检测系膜细胞miRNA-27a水平。　　2．8周龄SPF级健康雄性SD大鼠，体重为（220±20）g，适应性喂养1周。构建糖尿病（DM）动物模型，方法如下：禁食12 h后，1％链脲佐菌素（STZ）溶液按60 mg/kg一次性腹腔注射大鼠，正常（Control）组腹腔注射相当体积柠檬酸缓冲液，72 h后检测血糖（Blood Glucose，BG）水平，以连续3次BG≥16.7 mmol/L为DM成模标准。分别于4、8、12周末，麻醉动物，剥离肾脏，取肾上极约1mm3大小肾皮质迅速于4%预冷戊二醛中固定用于透射电镜观察；另取部分肾皮质组织置于4%多聚甲醛内固定用于免疫组化检测及 HE染色光镜观察；其余肾皮质组织快速置于液氮中，TaqMan探针实时荧光定量PCR检测系膜细胞miRNA-27a水平。　　结果:　　1．与正常糖培养的MCs相比，miRNA-27a在高糖培养的MCs中的表达明显升高，并呈时间依赖性模式（P<0.05）。　　2．与正常对照组相比，糖尿病大鼠肾皮质miRNA-27a表达水平明显升高，并呈时间依赖性模式（P<0.05）。　　3．肾脏组织病理学检测结果：HE染色光镜观察显示Control组大鼠肾小球结构未见明显异常，DM组大鼠肾小球体积明显增大，系膜细胞异常增生，肾小球系膜基质明显增多，基底膜异常增厚。透射电镜超微结构显示Control组大鼠肾小球结构清晰可见，基底膜无增厚，足细胞足突分布均匀，DM组大鼠肾小球基底膜明显增厚，且厚薄不均一，足细胞足突逐渐融合、缺失。糖尿病大鼠肾脏上述病理变化随糖尿病病程的延长而加剧。免疫组化结果发现 DM组大鼠肾小球ECM蛋白如胶原IV、纤连蛋白表达较Control组明显升高（P<0.05），并呈时间依赖性模式。　　结论:　　miRNA-27a在高糖培养的肾小球MCs及STZ诱导的糖尿病大鼠肾皮质中表达明显升高；miRNA-27a表达的上调同时伴有肾脏肥大及系膜外基质堆积的增加，提示miRNA-27a可能和系膜细胞损伤有关。　　第二部分调节miRNA-27a对高糖培养的肾小球系膜细胞PPARγ的影响研究　　目的:　　探讨miRNA-27a对高糖培养的肾小球系膜细胞PPARγ的靶向调节作用。　　方法:　　体外正常糖浓度（5.6 mmol/L）培养大鼠肾小球MCs，用Iipofectamine2000分别转染miRNA-27a mimics（miR-27a mimics组）、miRNA-27a inhibitors及阴性对照（NC mimics组和NC inhibitors组）。将未转染MCs分为正常糖培养组（NG组）和单纯高糖（25 mmol/L）培养组（HG组）。将转染miRNA-27a inhibitors后的MCs培养于高糖（25 mmol/L）环境下（miR-27a inhibitors组）。处理72 h后，TaqMan探针实时荧光定量PCR检测系膜细胞miRNA-27a水平；实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测PPARγ mRNA水平；Western blotting法检测PPARγ蛋白水平。细胞免疫荧光化学法检测 PPARγ的表达及分布。构建含有PPARγ-3′UTR靶标克隆野生型载体及 PPARγ-3′UTR靶标克隆突变型载体（mut-PPARγ-3′UTR），将这些载体与miRNA-27a过表达或miRNA-27a抑制载体共转染 MCs，转染48 h后，通过双荧光素酶报告实验检测 miRNA-27a对PPARγ-3′UTR荧光活性的影响。　　结果:　　1．miR-27a mimics组 MCs中 miRNA-27a的水平明显高于 NG组及 NC mimics组（P<0.05）；miR-27a inhibitors组MCs中miRNA-27a的水平明显低于HG组及NC inhibitors组（P<0.05）；而NG组和NC mimics组比较，HG组和NC inhibitors组比较，MCs中miRNA-27a的水平差异无统计学意义（P>0.05）　　2．与NG组比较，HG组PPARγ mRNA及蛋白水平明显降低（P<0.05）；miR-27a mimics组 MCs中 PPARγ mRNA及蛋白水平明显明显低于 NG组（P<0.05）；miR-27a inhibitors组MCs中PPARγmRNA及蛋白水平明显高于HG组（P<0.05）。NC mimics和NC inhibitors对PPARγmRNA及蛋白水平无明显影响（P>0.05）。　　3．细胞免疫荧光化学结果显示：PPARγ积聚于细胞核内，miRNA-27a mimics可以明显抑制PPARγ的表达（P<0.05），而miRNA-27a inhibitors则可以明显抑制高糖诱导的PPARγ的表达下调（P<0.05）。　　4．荧光素酶报告结果显示：miRNA-27a mimics可以明显抑制PPARγ-3′UTR荧光活性（P<0.05），而miRNA-27a inhibitors则可以抑制miRNA-27a mimics引起的PPARγ-3′UTR荧光活性的降低（P<0.05）。　　结论:　　miRNA-27a可通过与PPARγ-3′UTR结合抑制PPARγ的表达。　　第三部分 miRNA-27a通过调节PPARγ介导高糖诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质堆积　　目的:　　探讨 miRNA-27a对高糖诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质堆积的影响及作用机制。　　方法:　　1．体外正常糖浓度（5.6 mmol/L）培养大鼠肾小球MCs，Iipofectamin2000瞬时转染 miRNA-27a inhibitors、PPARγ siRNA载体或共转染 miRNA-27a inhibitors及PPARγsiRNA。将单纯转染miRNA-27a inhibitors、共转染miRNA-27a inhibitors和PPARγsiRNA后的MCs培养于高糖（25 mmol/L）环境下。处理72 h后，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组胶原蛋白IV（Collagen IV, Col IV）、纤连蛋白（Fibronectin, FN）、TGF-β1、PAI-1的mRNA表达水平；Western blotting法检测p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表达水平；CCK-8实验检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期变化情况。　　2．体内实验通过STZ诱导建立糖尿病大鼠动物模型，运用反义寡核苷酸技术，设计合成化学修饰的antagomir-27a及miRNA-27a antagomir阴性对照（NC antagomir）。糖尿病大鼠随机分为3组：糖尿病未治疗组，antagomir-27a治疗组及NC antagomir组。以正常大鼠作为正常对照组（Control组）。每两周监测血糖及24 h尿蛋白变化情况。8周末，处死动物，剥离肾脏，TaqMan探针实时荧光定量PCR检测系膜细胞miRNA-27a水平；qRT-PCR检测各组PPARγ、TGF-β1、PAI-1 mRNA水平；Western blotting法检测PPARγ、p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表达；免疫组化检测肾小球Col IV和FN表达水平；HE染色及透射电镜观察肾脏病理学变化情况。　　结果:　　1．与正常糖培养的大鼠肾小球MCs相比，高糖明显增加MCs中Col IV、FN、TGF-β1、PAI-1的 mRNA水平及p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白水平（P<0.05）；而 miRNA-27a inhibitors可显著抑制高糖对上述指标的影响（ P<0.05）；当miRNA-27a inhibitors与PPARγsiRNA共转染细胞时，miRNA-27a inhibitors的作用被PPARγsiRNA阻断（P<0.05）。　　2．与正常糖环境下培养的MCs相比，高糖环境下MCs明显增殖（P<0.05）；细胞周期检测显示G0/G1期细胞比例升高（P<0.05），S期细胞比例降低（P<0.05）。miRNA-27a inhibitors干扰后MCs增殖明显被抑制，并抑制高糖诱导的G1期细胞周期阻滞（P<0.05）；PPARγ siRNA则可阻断miRNA-27a inhibitors的上述效应（P<0.05）。　　3．与Control组比较，糖尿病未治疗组血糖水平明显升高（P<0.05），但不随糖尿病病程的延长而逐渐增加；而antagomir-27a治疗后对血糖水平无明显影响（P>0.05）。4、6、8周末，糖尿病未治疗组24 h尿蛋白水平较Control组明显升高（P<0.05），且随时间的延长而逐渐增加；antagomir-27a治疗后明显降低24 h尿蛋白水平（P<0.05）。　　4．antagomir-27a治疗组肾皮质中 miRNA-27a水平明显低于糖尿病未治疗组（P<0.05），而NC antagomir对miRNA-27a水平无明显影响（P>0.05）。　　5．antagomir-27a治疗组肾皮质中PPARγ mRNA及蛋白水平明显高于糖尿病未治疗组（P<0.05），而 NC antagomir组与糖尿病未治疗组比较，肾皮质中PPARγ表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。　　6．与糖尿病未治疗组相比，antagomir-27a治疗组TGF-β1、PAI-1 mRNA水平明显降低（P<0.05），p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表达显著降低（P<0.05）。而NC antagomir组与糖尿病未治疗组比较，肾皮质中上述指标水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。　　7．免疫组化结果显示antagomir-27a治疗组Col IV和FN水平较糖尿病未治疗组明显降低（P<0.05）；而NC antagomir组与糖尿病未治疗组比较两者水平无显著性差异(P>0.05)。　　8．HE染色显示antagomir-27a治疗组大鼠肾小球系膜细胞增生及系膜基质增多程度均较糖尿病未治疗组明显减轻。透射电镜超微结构显示糖尿病未治疗组大鼠基底膜明显增厚且不光滑，足细胞足突大面积融合、缺失，系膜细胞和基质结节性显著增生；antagomir-27a治疗组大鼠足细胞足突融合明显改善，系膜细胞和基质增生明显减轻。　　结论:　　1．miRNA-27a inhibitors明显抑制高糖诱导的肾小球MCs增殖及ECM蛋白过度堆积，其机制可能是通过调节其靶基因PPARγ水平来实现的。　　2．antagomir-27a治疗明显降低糖尿病大鼠尿蛋白水平，改善糖尿病肾脏的病理变化，减少系膜细胞增生及基质堆积，对糖尿病肾脏起保护作用。

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中英文缩略词

引言

第一部分 miRNA-27a在高糖培养的肾小球系膜细胞及糖尿病大鼠肾皮质中的表达研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 调节miRNA-27a对高糖培养的肾小球系膜细胞PPARγ的影响研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 miRNA-27a 通过调节PPARγ介导高糖诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质堆积

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文小结

综述:MicroRNAs和糖尿病肾病的研究进展

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢