miR-192靶向TCF7基因对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用

摘要

研究背景：　　骨肉瘤（osteos arco ma）是较常见的恶性骨肿瘤，主要影响儿童和青少年。骨肉瘤具有较强的迁移能力，导致许多患者死于肺转移。虽然人们在骨肉瘤的治疗上投入很多精力，但患者五年生存率仍仅达60％-70%。目前，人们的研究主要集中在后基因组方面，因此，从基因水平上探讨骨肉瘤发生发展的分子机制，寻找新的诊断和防治方法显得尤为重要。MicroRNA（miRNA）是一类保守的内源性非编码小RN A，通过转录和转录后水平调控基因的表达。miRN A参与许多生物过程，如细胞的增殖、血管生成、细胞代谢等，其异常表达与肿瘤的发生及进展密切相关。最新研究报道，miR-192在多种肿瘤细胞中低表达，如肺癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和骨肉瘤。然而，关于miR-192对骨肉瘤细胞生物学行为的影响尚未见报道。因此，探讨miR-192对人骨肉瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移的影响，揭示其相关的作用机制，将为骨肉瘤的临床防治提供新的思路和策略　　研究目的：　　本实验通过骨肉瘤患者组织标本，检测骨肉瘤组织及其癌旁组织中miR-192及TCF7基因表达差异。采用骨肉瘤U-2OS和MG63细胞，观察转染miR-192对骨肉瘤增殖、凋亡及侵袭迁移的影响，并初步探索miR-192的生物靶标及其调控机制，为miRN A在骨肉瘤的防治的作用提供实验依据和新靶点。　　方法：　　1.在郑州大学第一附属医院（2013年6月至2015年3月期间）收集20例骨肉瘤患者癌组织及其癌旁组织标本，-80℃保存。使用荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）方法检测20例骨肉瘤组织及其癌旁组织标本中miR-192及TCF7基因 mRNA的表达水平，并分析二者之间的关系。同时采用免疫印迹法（Western blot）检测TCF7蛋白的表达水平。　　2.采用RT-qPCR方法检测成骨细胞hFOB1.19，骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中miR-192及TCF7基因的mRN A表达水平。　　3.合成miR-192 agomir和miR-192 negative control，并采用脂质体转染法将其分别转入骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中。实验分组如下：　　①miR-192组：转染miR-192 a go mir。　　②NC组：转染miR-192 negative control。　　③Blank组：仅转染试剂脂质体。　　4.CCK-8法检测细胞生长实验和集落形成实验，观察miR-192对骨肉瘤细胞增殖的影响。　　5.流式细胞术和Caspase酶活性实验，观察miR-192对骨肉瘤细胞凋亡的影响。　　6.细胞划痕实验，观察miR-192对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。　　7.Tra nswe ll实验，观察miR-192对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。　　8.采用PicTar、miRwalk、TargetScan和miRanda等生物信息学软件预测miR-192的作用靶标。同时构建含有TCF7的3’-UTR区的野生型和突变型的重组双荧光素酶报告基因载体，分别将其与miR-192 agomir或miR-192 negative control一起共转染入骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中，并运用Western blot实验方法和双荧光素酶报告实验证实TCF7是miR-192的作用靶标。　　9.Western blot检测各组细胞转染miR-192 agomir后，骨肉瘤细胞U-2OS及MG63中细胞周期蛋白CyclinD1，凋亡抑制蛋白Survivin和与侵袭迁移相关的蛋白Sna il的表达。　　结果：　　1.与癌旁组织相比，骨肉瘤组织中，miR-192的表达明显降低(P<0.01)，TCF7 mRNA的水平明显升高(P<0.01)，并且miR-192的表达与TCF7 mRNA的水平呈负相关。此外，骨肉瘤组织中TCF7的蛋白表达也高于癌旁组织。　　2.骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中，miR-192的表达明显低于成骨细胞hFOB1.19(P<0.01)，TCF7 mRNA表达明显高于成骨细胞hFOB1.19(P<0.01)。　　3.转染miR-192 ago mir后，miR-192转染组的miR-192表达水平显著高于NC组和Blank组，其差异具有统计学意义(P<0.01)。表明骨肉瘤细胞转染miR-192后，骨肉瘤细胞的miR-192表达水平明显上调。　　4.CCK-8（Cell Counting Kit）生长实验和集落形成结果显示，与NC组和Blank组比较，miR-192组的骨肉瘤细胞在OD450处的吸光度值明显下降，集落形成数目也明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，而NC组和Blank组间比较骨肉瘤细胞的吸光度和集落形成数目无显著性差异(P>0.05)。　　5.流式细胞术检测细胞凋亡实验和Caspase-3酶活性检测实验结果显示，与NC组和Blank组比较，miR-192组骨肉瘤细胞的细胞凋亡率和Caspase-3酶活性均明显升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)，而NC组和Blank组间比较骨肉瘤细胞的凋亡数和Caspase-3活性无显著性差异(P>0.05)。　　6.Transwell实验结果显示，与NC组和Blank组相比较，miR-192组的骨肉瘤细胞穿过基底膜的细胞数明显减少，其差异具有统计学意义(P<0.05)，而 NC组和Blank组间比较穿过基底膜的骨肉瘤细胞数无显著性差异(P>0.05)。　　7.划痕实验结果提示，与NC组和Blank组比较，miR-192组细胞的迁移能力明显降低，而N C组和Bla nk组间比较细胞的迁移能力无显著性差异。　　8. Western blot和双荧光素酶报告实验结果提示，TCF7是miR-192的作用靶标。　　9.Western blot结果提示，转染miR-192 agomir后，与NC组和Blank组比较，miR-192组中，细胞周期蛋白CyclinD1，凋亡抑制蛋白Survivin与侵袭迁移相关的蛋白Snail的表达均下降，而NC组与Blank组比较，细胞中CyclinD1，Survivin和Snail蛋白的表达无差异。　　结论：　　1.骨肉瘤组织和细胞中，miR-192异常低表达，TCF7高表达，二者呈现负相关。　　2.miR-192通过作用于TCF7的3’-UTR区负向调控其表达，并抑制其下游相关基因CyclinD1，Survivin和Snail的表达，从而发挥生物学作用。　　3.上调骨肉瘤细胞中miR-192的表达能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进骨肉瘤细胞的凋亡。

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1 引言

2 材料和方法

2. 1 材料

2. 2 实验方法

3 实验结果

3. 1 骨肉瘤组织中miR-192和T CF 7的表达及相关性

3. 2 人正常成骨细胞和骨肉瘤细胞中miR-192与TC F 7 mR NA的表达

3. 3 骨肉瘤细胞的转染效果检测

3. 4 m iR-192对骨肉瘤细胞增殖的影响

3. 5 m iR-192对骨肉瘤细胞凋亡的影响

3. 6 m iR-192对骨肉瘤细胞侵袭的影响

3. 7 m iR-192对骨肉瘤细胞迁移能力的影响

3. 8 m iR-192靶基因的预测

3.9 Western blot验证miR-192的靶基因

3. 10 双荧光素酶报告实验验证miR-192的靶点

3.11 Western blot检测TCF7、CyclinD1、Survivin和Snail的表达

4 讨论

5结论

参考文献

综述:Mic roRNA在骨肉瘤发病机制及防治中的作用

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