MHC区域遗传多态性对食管癌发病风险和预后的影响

摘要

1、研究背景和目的　　我国是食管癌(esophagealcancer,EC)高发地区，特别是河南、河北、山西三省交界的太行山南麓，食管癌发病率高达105.17/10万。全国每年新发25万例食管癌患者，占全球新发食管癌总数的50％以上。地域分布差异和家族聚集现象是食管癌显著的流行病学特征，提示环境和遗传因素的交互作用对食管癌的发生有着重要的影响。最近的研究表明，人类自身的免疫防御机制也是影响食管癌发生发展的重要因素之一。人类主要组织相容性复合体(humanmajorhistocompatibilitycomplex，MHC)与自身免疫防御有着密切的关系，参与人体的免疫应答遗传调控和免疫细胞的识别和限制。缺乏MHC的抗原呈递作用有助于癌细胞的免疫逃逸，最终导致肿瘤的发生并影响患者的预后。许多学者采用免疫组织化学、DNA甲基化、反转录-聚合酶链反应等方法对MHC区域基因表达变化与食管癌的关系进行研究，发现MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子缺失，甲基化等不仅促进EC发生，且影响患者预后。MHC区域另一重要变化是单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNP），SNPs与食管癌发病风险及预后已有较多研究报道，但是，MHC区域SNPs变化与食管癌发病风险和预后的关系尚无明确结论。　　本研究旨在通过全基因组关联分析(GenomeWideAssociationStudies，GWAS)技术，对MHC区域的SNP位点进行检测，寻找与食管癌发病风险相关的SNP位点，并进一步探讨基因多态性和相关基因在食管癌组织和癌旁的正常上皮组织中的蛋白表达与临床病理特征的关系及对预后的影响。为大规模人群筛查和个体化治疗提供分子靶标及理论依据。　　2、材料与方法　　2.1研究对象　　3634例样本均来自河南省食管癌重点开放实验室食管癌生物样品信息资料库，实验方法设计采用病例-对照研究。其中病例组1，528例（男921例，女607例，平均年龄60.79±8.93岁），对照组2，106例（男1，051例，女1，055例，平均年龄31.15±14.78岁）。病例组均经组织病理学确诊为食管鳞状细胞癌(ESCC)，对照组均经内镜检查排除早期ESCC和其他上消化道肿瘤。　　2.2血样采集和DNA提取　　从食管癌高发区当地医院收集血液样本和流行病学资料。在研究对象知情同意并签署书面知情同意书后，对每一位研究对象进行问卷调查，并采集空腹外周静脉血3～5ml，置于5ml的EDTANa2抗凝管中，-20℃冰箱冷藏。采用QiagenFlexiGeneDNA试剂盒对收集的血样提取基因组DNA。利用NanoDrop分光光度计(ND-2000)对DNA的含量进行测量。参加本课题的所有医院均已按照赫尔辛基原则宣言经单位的伦理委员会通过。　　2.3食管癌组织的收集　　49例食管鳞癌标本均为手术切除后标本，且经病理诊断证实为食管鳞状细胞癌(ESCC)。其中男性22例（最大年龄70岁，最小年龄50，平均年龄为60±6岁），女性27例（最大年龄76岁，最小年龄54，平均年龄为62±6岁）。所有患者术前均未接受任何化、放疗。　　2.4问卷调查、医院资料核实和生存随访　　采用入户问卷调查和/或电话随访对患者的基本信息和生存状况进行记录，并根据患者提供的治疗医院，复核、补充患者治疗方式和病理诊断。随访时间从手术当日起，截止到2013年7月8日。　　2.5SNP筛选　　2.5.1采用主成分(principalcomponent，PC)分析的方法，排除遗传学上偏倚度较大的人群1050例人群后，最终遗传匹配进入GWAS初筛的病例组1，528例（男921例，女607例，平均年龄60.79±8.93岁），对照组1，056例（男527例，女529例，平均年龄31.15±14.78）。　　2.5.2使用Illumina610芯片对匹配的病例和对照组人群进行MHC区域的全部SNPs扫描分析，共检测出6252个SNPs。去除样本得率(callrates)＜90％的SNP后，进行等位基因的质量控制，其标准是:最小等位基因频率(minorallelefrequency，MAF)＞0.01，GENO＜0.1，MIND＜1，哈迪·温伯格平衡率(Hardy-Weinberg，HWE)＞0.001。按此标准排除不合格样本后，用Cochran-Armitage趋势检验分析，筛选出在MHC区域可能与食管鳞癌高风险有关的SNP。　　2.6免疫组织化学　　免疫组织化学实验方法采用本实验室已建立的卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物法(ABC法)。　　2.7统计分析　　计算样本得率、哈迪·温伯格(Hardy-Weinberg;HWE)平衡律、最小等位基因频率(minorallelefrequency，MAF);用Plink1.03软件分析进行基因分型和质量进行控制后的SNPs数据，用Cochran-Armitage趋势检验计算P值、优势比(Oddsratio，OR)和95％可信区间(95％confidenceinterval，95％CI)。在MHC区域中符合条件的SNPs进行了条件logistic回归分析。临床资料和病理特征的各亚组的分层分析使用SPSS17.0进行卡方检验。用Kaplan-Meier方法绘制SNP位点与预后的生存曲线，并用Log-rank检验生存率之间的差异。检验标准取α=0.05。　　3、结果　　3.1SNP筛选　　在MHC区域共检测出6，252个SNP。最终在MHC区域发现6个可能与食管鳞癌高风险有关的SNP，对应5个基因，分别为rs17533090和rs35399661(HLA-DQA1)、rs376333(TRIM27)、rs2844695(LOC46570)、rs1536501(LEMD2)和rs911178(SCAND3)。　　3.2分层分析　　HLA-DQA1基因rs17533090位点的基因多态性与性别相关(P=0.002)，rs35399661位点的基因多态性与年龄(P=7.18E-15)、分化程度(P=1.64E-04)、浸润程度(P=5.80E-04)、淋巴结转移(P=6.45E-04)和病理分期(P=7.99E-04)相关;LOC46570基因rs2844695位点的基因多态性与年龄(P=0.006)相关;SCAND3基因rs911178位点的基因多态性与年龄(P=8.58E-06)、淋巴结转移(P=0.028)相关。　　3.3各基因型的生存分析　　HLA-DQA1基因rs35399661位点AG/GG型的患者预后比AA型好(x2=93.673，P=3.72E-22)、LOC46570基因rs2844695位点AG/GG型的患者预后比AA型好（x2=38.067，P=6.84E-10）、SCAND3基因rs911178位点AG/GG型的患者预后比AA型好(x2=17.189，P=3.38E-05)。　　3.4HLA-DQA1蛋白表达　　HLA-DQA1蛋白在食管癌组织中的阳性率为69.4％，明显高于癌旁正常上组织30.0％(P=2.17E-04)，且胞浆着色明显;＜60岁的患者癌组织中HLA-DQA1蛋白阳性率明显低于≥60岁患者，HLA-DQA1蛋白阳性表达的食管癌患者预后明显比阴性者差(P=0.042)。　　4、结论　　1.MHC区域的rs17533090和rs35399661(HLA-DQA1)、rs3763338(TRIM27)、rs2844695(LOC46570)、rs1536501(LEMD2)、rs911178(SCAND3)与食管癌的高风险相关，提示逃避机体免疫监视系统可能是ESCC发生的又一重要机制。　　2.HLA-DQA1基因的rs35399661位点AG/GG型、LOC46570基因的rs2844695位点AG/GG型、SCAND3基因的rs911178位点AG/GG型与患者的生存期相关。　　3.HLA-DQA1蛋白在食管癌组织中的表达阳性率明显高于癌旁正常上皮组织且与患者的发病年龄及预后相关。

目录

声明

摘要

图和附表清单

符号说明

第一部分 MHC区域单核苷酸多态性与食管鳞状细胞癌高风险及预后的关系

1 前言

2材料与方法

2．1 研究对象

2．2 血样采集

2．3 问卷调查、医院资料核实和生存随访

2．4 入选标准

2．5 主要实验试剂和仪器

2．6 实验方法和步骤

2．7 统计学分析

3结果

3．1 SNP基因分型和质量控制及条件logistic回归分析

3．2 基因多态性与ESCC临床资料和病理特征的关系

3．3 基因多态性与ESCC预后的关系

4讨论

4．1 HLA-DQA1基因(rs17533090、rs35399661)与ESCC患者预后的关系

4．2 TRIM27基因(rs3763338)与ESCC患者预后的关系

4．3 LOC646570基因(rs2844695)与ESCC患者预后的关系

4．4 LEMD2基因(rs1536501)与ESCC患者预后的关系

4．5 SCAND3基因(rs911178)与ESCC患者预后的关系

5结论

参考文献

第二部分 HLA-DQA1与食管鳞癌临床病理特征及预后的关系

1研究背景

2材料与方法

2．1 研究对象

2．2 组织处理

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂

2．5 实验步骤

2．6 免疫组织化学阳性评分标准

2．7 统计学分析

3结果

3．1 HLA-DQA1蛋白免疫组织化学染色结果

3．2 ESCC患者不同年龄、性别HLA-DQA1的表达情况

3．3 ESCC患者不同病理特征HLA-DQA1的表达情况

3．4 食管癌组织中HLA-DQA1蛋白表达与预后差异

4 讨论

5结论

参考文献

综述一 食管癌相关分子生物学研究进展

综述二 MHC与恶性肿瘤关系的研究进展

附录

个人简历

博士研究生学习期间发表的文章及参加的国际会议